空載納米粒子膽管癌細胞論文范文

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1材料與方法

1.1空載納米粒子體外溶血試驗在紅細胞懸浮液中加入蒸餾水，由于滲透壓差異導致紅細胞破裂作為陽性對照，在紅細胞懸浮液中加入PBS使得紅細胞不破裂作為陰性對照組，選取兩種高濃度（2mg/mL、1mg/mL）的空載納米粒子進行了溶血測試。

1.25-FU-PCL-NP的體外釋藥研究使用分光光度計對5-FU溶液進行200~400nm的全波長掃描，確定了5-FU在水相環境下的最大吸收波長為266.4nm，調整至標準曲線模式，分別選擇最大吸收波長作為光源，進行5-FU標準曲線的繪制，通過這條標準曲線，藥物釋放環境下，分別于0、12、24、36、48、72h測得吸光度值，并根據標準曲線計算釋藥量，繪制釋藥曲線。

1.3細胞培養Hccc-9810細胞在含10%胎牛血清的1640培養基中，37℃，5%CO2飽和度下培養。

1.4CCK-8法測定腫瘤細胞增殖抑制實驗取處于對數生長期的Hccc-9810細胞，接種于96孔板，調節細胞濃度，使每孔細胞數為8000個，37℃，5%CO2飽和度下培養箱孵育過夜，待細胞貼壁后，分按空白NP組，單純5-FU組，5-FU-PCL-NP組（按載藥率折算5-FU的量），分別按5-FU藥物濃度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每個濃度組設立5個復孔，共培養48h，后均用CCK-8法檢測各孔存活細胞吸光度。細胞存活率=（處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值–空白對照組OD值）×100%。同時計算半數有效濃度（IC50）值。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率取處于對數生長期的Hccc-9810細胞，接種于6孔板，調節細胞濃度，使每孔細胞數為2×105個，將細胞分為：空白對照組、空載納米粒組、單純5-FU組、5-FU-PCL-NP組；根據CCK-8實驗所篩選出半數有效濃度，按5-FU1.5μg/mL分別加藥共培養細胞48h，用不含EDTA的胰酶消化收集收集6孔板細胞，PBS清洗2遍，加入500μL的結合緩沖液懸浮細胞，加入分別5μLAnnexinV，5μLPropidiumIodide混勻；避光，室溫下反應15min，后上機檢測細胞凋亡率。

1.6統計學處理所有實驗均重復3次，統計資料結果以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P<0.05表示差異有統計學意義。使用SPSS19.0軟件進行統計分析。

2結果

2.15-FU-PCL-NP形態觀察透射電鏡照片所示，5-FU-PCL-NP呈現出完好的球形形態，分布均勻無粘連情況，表明成功合成相關載藥納米材料，并且結構穩定（圖1）。

2.2空載納米粒子體外溶血試驗體外溶血試驗結果顯示，陽性對照組出現明顯溶血，陰性對照組及2個濃度的空載納米粒子組均未出現溶血。

2.35-FU載藥納米粒子的體外藥物釋放體外釋藥實驗結果顯示，單純5-FU在8h內即達峰值；而5-FU-PCL-NP的釋放比較平緩，在前24h達50%，在72h后達到62.9%（圖3）。

2.45-FU-PCL-NP對Hccc-9810細胞增殖抑制作用單純5-FU及5-FU-PCL-NP分別按按5-FU藥物濃度0、5、10、15、20、40、80μg/mL與Hccc-9810細胞共培養48h之后，細胞活性隨藥物濃度上升而下降，5-FU-PCL-NP組對細胞的增殖抑制作用明顯強于單純5-FU（P<0.05）。5-FU-PCL-NP組與單純5-FU組的IC50分別為（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率流式細胞儀檢測結果顯示，空白對照組和空載納米粒子組凋亡率分別為（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，兩組間差異無統計學意義（P>0.05）；5-FU-PCL-NP組凋亡率為（37.5±4.5）%，而單純5-FU組細胞凋亡率分別為（26.4±3.2）%，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

3討論

膽管癌是消化道較常見的惡性腫瘤之一，發病率呈上升趨勢，由于其惡性程度高，早期診斷困難，且因其周圍解剖結構復雜，容易向周圍組織侵潤，手術R0切除率低（約15%~20%），預后較差，因此近年來針對膽管癌的非手術治療逐漸成為研究的熱點。

5-FU為治療消化道惡性腫瘤的經典藥物，Thongprasert等報道以5-FU為基礎的化療組患者對膽管癌控制率可達50%。但其治療劑量較大，為增強療效而加大劑量會帶來毒性作用，臨床上患者表現為強烈的化療后副反應，往往不易耐受。因此通過藥物的緩釋，減慢藥物代謝，增加作用時間窗，提高療效具有重要的臨床意義。

納米微球由于粒徑小、比表面積大，具有特殊的體積效應和表面效應，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、電性、親和性等，這有利于增加所載藥物在吸收部位的接觸時間和接觸面積，加之其對藥物具有明顯的保護作用，故可大大提高藥物的吸收和生物利用度，并可延長其在體內的循環時間，大大增加作用時間窗。聚己內酯材料是一種新型的生物可降解材料，本實驗合成了5-FU-PCL-NP，其載藥率為15.1%，包封率為41.9%，并通過透射電鏡證明了其成功合成，具有穩定的形態，同時體外藥物緩釋實驗結果表明單純5-FU在前8h即達峰值，而5-FU-PCL-NP的釋放在前24h達50%，說明具有一定突釋作用，后釋放趨于平穩，至72h后達到62.9%，表明該材料具有良好的藥物緩釋作用。體外溶血試驗結果表明，高濃度的納米材料也不會引起細胞的溶血，證明了其較好的生物安全性。CCK-8增值抑制實驗表明5-FU-PCL-NP對腫瘤細胞的增值抑制作用優于單純5-FU，進一步應用流式細胞儀檢測凋亡，結果提示5-FU-PCL-NP明顯促進了腫瘤細胞的凋亡，表明載藥納米粒子在細胞吸收后，通過緩釋作用，增強了作用時間，促進腫瘤細胞的凋亡增強了藥物的殺傷作用。

綜上所述，5-FU-PCL-NP具有良好的生物安全性，緩釋作用，可以明顯增強藥物的抑制增殖效果，并能誘導人膽管癌細胞的凋亡。本研究結果為載藥納米給藥系統的開發和應用提供了一定的實驗基礎，為膽管癌的藥物治療提供了新的思路，同時隨著后期相關官能團的修飾，可以進一步實現腫瘤的靶向治療，對于改善膽管癌患者的預后具有重要意義。

作者：李永盛賀思佳江翰邊睿王碩郝袁王雪峰劉穎斌徐雷鳴施偉斌單位：上海交通大學醫學院附屬新華醫院普通外科膽道研究所消化內科