葉酸抑制胃癌細胞論文范文

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1實驗資料

1.1實驗分組按事先轉染的成分不同以及后續培養基不同分為先行PLK－1siRNA干擾然后在無葉酸培養基中培養72h組(Null+PLKS組)、先行PLK－1siRNA干擾然后在正常葉酸濃度培養基中培養72h組(Control+PLKS組)、無PLK－1siRNA而用PBS作對照的轉染然后在無葉酸培養基中培養72h組(Null+PBS組)、無PLK－1siRNA而用PBS作對照的轉染然后在正常葉酸濃度培養基中培養72h組(Control+PBS組)。

1.2實驗方法

1.2.1PLK－1siRNALipofectamineTM2000的轉染轉染過程嚴格按照說明書施行。其基本步驟為:轉染前24h，在每塊6孔板的每個孔內用2mL不含雙抗的RPMI1640培養基接種對數生長期的腫瘤細胞5×105個。經過24h，細胞融合度為40%。用250μLOpti－MEM培養基稀釋siRNA(siRNA的量為100pmol)，混勻。用250μLOpti－MEM稀釋5．0μLLipofectamineTM2000，混勻，室溫下靜置5min。將以上混合轉染試劑和siRNA稀釋液混勻，室溫下靜置20min。轉染復合物加入到6孔細胞板中，前后輕搖細胞板混合均勻。轉染6h后換新鮮培養基。

1.2.2Real－timePCR和Westernblot驗證PLK－1siRNA干擾的效果細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養72h，然后用RIPA和Trizol分別提取蛋白和RNA。蛋白以GAPDH為內參，用Westernblot檢驗其表達差別。siRNA經反轉錄成cDNA后行Real－time檢測PLK－1siRNA的轉錄水平差別。PLK－1和GAPDH的引物由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2.3CCK－8檢測細胞增殖情況經不同PLK－1siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，6h后，胰酶消化收集細胞，將其按96孔板每個孔2000個細胞的密度接種，每次取5復孔，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養基和不含葉酸的培養基后，分別培養72h，然后棄去培養基，分別加入上述對應的培養基100mL和CCK－810μL的混合液，在培養箱內孵育3h，檢測吸光度，觀察細胞增殖情況。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡和增殖情況在6孔板轉染后，經不同PLK－1siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，干擾6h后吸去干擾液，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養基和不含葉酸的培養基，培養72h。收取上清液中的懸浮細胞+胰酶消化后的細胞，離心，PBS洗2次。然后按AnnexinV試劑盒操作流程染色。實驗總共設一個陰性對照管、AnnexinV和PI單染管和實驗管，每管細胞約1×106。室溫避光孵育15min，流式上機檢測細胞凋亡情況。對于周期，收集的各組細胞加入70%(PBS稀釋)－20℃無水乙醇2～3mL，4℃固定6h以上。1500r/min去上清，1mLPBS1500r/min5min清洗1遍，加入200μLPBS重新懸浮，調整細胞濃度為106～107，加入1%的Rnase60μL，37℃搖床水浴30min。加入20μL250μg/mL的PI，室溫避光孵育10min上機檢測。

1.2.5Westernblot檢測Bcl－2表達情況RIPA提取蛋白后，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物研究所)測定蛋白濃度，調整濃度后用SDS上樣緩沖液加熱變性后，蛋白電泳檢測蛋白表達差異。

1.3統計學方法使用SPSS19．0軟件包進行統計處理。所有結果用均數±標準差(x珋±s)表示。各組間差異比較使用析因方差分析，多組間均數比較采用F檢驗，均數間的兩兩比較采用q檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組PLK－1mRNA水平和蛋白表達情況轉染72h后檢測PLK－1mRNA和蛋白的表達情況。Real-timePCR檢測發現胃癌細胞系SGC7901和BGC823，PLK－1mRNA在用PLK－1siRNA干擾的PLKS組較PBS干擾的PBS組明顯降低，見圖1。同樣，在蛋白表達水平上，Westernblot顯示經PLK－1siRNA干擾，胃癌細胞系SGC7901和BGC823的PLK－1蛋白水平也明顯降低，見圖2及圖3。

2.2各組SGC7901和BGC823細胞增殖情況比較在接種相同數目細胞的前提下，細胞數目少反映PLKS組細胞增殖較慢。析因方差分析顯示葉酸缺乏和PLK－1siRNA對SGC7901和BGC823細胞增殖均有明顯影響，且葉酸缺乏和PLK－1siRNA對胃癌細胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分別為0．046和0．006)。因Null－PLKS組均數＜Null－PBS組均數+Control－PLKS均數－Control－PBS組均數(SGC7901和BGC823細胞系計算值分別為0．227＜0．316和0．309＜0．485)，所以葉酸缺乏和PLK－1對胃癌細胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有協同作用。

2.3各組SGC7901和BGC823細胞凋亡情況比較AnnexinV檢測細胞凋亡情況，流式圖橫坐標為標FITC的AnnexinV，縱坐標為PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(26．42±1．50)%，(5．13±1．24)%，(10．17±1．76)%和(6.17±2．47)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(24．28±2．90)%，(6．88±2．05)%，(13．30±2.58)%和(5.80±3．01)%。析因方差分析得出，PLK－1siRNA能促進凋亡，但葉酸缺乏對凋亡影響不大;葉酸缺乏與PLK－1siRNA之間有交互效應。因Null－PLKS組均數＜Null－PBS組均數+Control－PLKS均數－Control－PBS組均數(SGC7901和BGC823細胞系計算值分別為:26．42＞9.13和24．28＞14．38)，所以葉酸缺乏能增強PLK－1對胃癌細胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。

2.4各組SGC7901和BGC823細胞周期情況SGC7901G2/M比例在Null－PLKS組、Null－PBS組、Control－PLKS組和Control－PBS組分別為(20．88±2．55)%，(8．32±2．18)%，(19．49±1．98)%和(7．48±1．68)%;BGC823G2/M比例在各組分別為(22．95±2．71)%，(11．61±2．66)%，(22．01±2．94)%和(10．03±2．47)%。對數據進行統計，發現PLK－1siRNA能提高G2/M比例(P＜0．05)，但葉酸缺乏不能，而且葉酸缺乏和PLK－1siRNA之間也無交互作用(P＞0．05)。見圖6及圖7。

2.5各組SGC7901和BGC823細胞Bcl－2蛋白表達情況葉酸缺乏和PLK－1siRNA均能降低Bcl－2的表達，而且葉酸缺乏和PLK－1siRNA對BCL－2的表達有交互效應(P＜0．05)。鑒于兩者Null－PLKS組均數＞Null－PBS組均數+Control－PLKS均數－Control－PBS組均數，葉酸缺乏和PLK－1siRNA具有拮抗作用。

3討論

腫瘤是一個全身性疾病，手術對腫瘤尤其是中晚期腫瘤其是胃癌治療效果有限。基于腫瘤發生、發展機制的綜合治療，尤其是聯合治療有其特有的優勢。PLK－1作為PLK家族中被研究最多的一員，不僅在很多腫瘤中表達升高，而且它的升高還對諸如胃癌、結直腸癌的預后判斷具有價值。PLK－1參與了數個至關重要的有絲分裂步驟，如激活CDC25c磷酸化酶、調節有絲分裂過程等。PLK－1具有參與多個腫瘤發生、發展步驟的特點。所以，PLK－1被認為是重要的分子靶標，并被廣泛關注。Bcl－2是一個經典的抗凋亡蛋白，降低Bcl－2能促進腫瘤凋亡，抑制腫瘤生長。本實驗運用PLK－1的siR-NA敲低PLK－1后，胃癌細胞系SGC7901和BGC823的增殖降低，凋亡增加，細胞阻滯在G2/M期，且葉酸缺乏聯合PLK－1siRNA能抑制Bcl－2的表達，提示降低PLK－1可能通過Bcl－2途徑起作用，這與其他研究的結果類似。葉酸是生物體代謝重要的一碳單位，葉酸類似物如甲氨蝶呤被用作腫瘤的治療。本研究證實PLK－1siRNA能抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，葉酸缺乏也能抑制腫瘤的增殖，且葉酸能協同PLK－1siRNA抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡。但在抑制胃癌細胞Bcl－2的表達上有拮抗作用。

筆者認為，這可能與蛋白的作用往往不是與濃度呈線性關系有關，該結果有待進一步研究。葉酸缺乏和PLK－1siRNA協同抑制腫瘤的意義在于，使用PLK－1抑制劑時補充葉酸，尤其是大量補充應慎重。不僅如此，PLK－1抑制劑聯合臨床使用的抗葉酸制劑，如甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)等，能否達到更好治療腫瘤的目的也值得深入研究。

作者：查小應黃磊楊木清歐敬民陳大偉費哲為單位：上海交通大學醫學院附屬新華醫院上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院