胰腺腫瘤癌細胞論文范文

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1材料與方法

1.1研究方法

1.1.1Westernblot法依照蛋白提取試劑盒說明書進行各細胞株總蛋白的提取，BCA定量試劑盒進行蛋白濃度的測定，樣品定量為5g/L，于每條泳道進行上樣50μg蛋白，采用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺進行凝膠電泳，在電壓70V條件下經80min電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗，在4℃條件下孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗室溫條件下孵育1.5h，TBST清洗，采用ECL發光，以凝膠顯像儀進行顯像。采用QuantityOne進行灰度值檢測。

1.1.2qRT-PCR法按照RNA分離試劑盒及TRIzol試劑盒說明書步驟提取并純化各細胞株總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1g/L，依據逆轉錄及擴增試劑盒說明書規定步驟進行逆轉錄及擴增。總RNA濃度測定：用DEPC水調零后取1.5μL樣品置于ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測樣臺上進行測量，對A260/A280值以及濃度進行記錄，總RNA樣品在A260/A280為1.8~2.0，RNA純度較高，無DNA、蛋白質等污染，濃度為100~1458.2μg/μL。總RNA完整性檢測：取RNA樣品1μL，1%瓊脂凝膠電泳80V電壓電泳20min，EB染色10min，于凝膠成像系統下觀察并進行拍照。結果顯示5sRNA、18sRNA、28sRNA條帶完整，總RNA抽取完整。RT-PCR反應體系為（2×All-in-OneqPCRMix10μL，45×SyberGreen2μL，PrimerF1μL，PrimerR1μL，cDNA2μL，ddH2O4μL），反應條件如下：95℃預變性10min；95℃變性10s、60℃退火20s、72℃延伸10s，45個循環。所有反應均設立復孔，并以DEPC水代替模板，cDNA作為陰性對照。

1.1.3siNDRG1及陰性對照序列轉染PANC-1細胞siNDRG1及陰性對照序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。轉染前24h取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化成單細胞懸液，分別以10×104和20×104/孔接種至24孔板中，對融合達到70%~90%的細胞株進行轉染，細胞分3組：空白對照組、siNDRG1組及陰性對照組。對siNDRG1組及陰性對照序列組依照LipofectamineTM2000試劑說明書步驟進行轉染，轉染48h后按照miRNA提取及分離試劑盒說明書步驟進行總RNA完整性檢測，應用紫外線分光光度儀檢測RNA溶解光密度值A（介于260~280nm處比值），計算RNA的濃度及純度，比值為1.8~2.1者可用于進一步實驗。采用Westernblot法及qRT-PCR對轉染后PANC-1細胞中NDRG1在蛋白水平及mRNA水平表達的轉染效率進行檢測。并采用Westernblot法及qRT-PCR對PANC-1細胞siNDRG1轉染后MMP-7在蛋白水平及mRNA水平表達進行檢測。

1.1.4MTT法檢測轉染后PANC-1細胞增殖取各組PANC-1細胞，按MTT試劑盒操作步驟，以5×103細胞/孔密度接種于96孔細胞培養板內，并設立3個復孔，培養24、48、72、96、120h后，每孔內加入5mg/mLMTT液2μL，繼續進行溫育4h，棄上清后加入DMSO150μL，進行振蕩溶解結晶，比色選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上進行各孔光吸收值測定，并重復3次試驗，取平均值。

1.1.5流式細胞儀檢測轉染后PANC-1細胞調亡PANC-1細胞進行轉染48h后，取各組細胞，依照AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書步驟進行操作，流式細胞儀AlexaFITC最大激發波長488nm，最大發射波長為509nm，PI-DNA復合物最大激發波長為535nm，最大發射波長為615nm，采用軟件CellQuest進行分析。AlexaFITC為X軸，PI為Y軸，每個樣本采集為10000個細胞，區分開早期調亡細胞、晚期調亡細胞及繼發壞死細胞區，計算出陽性細胞的百分比例，并重復3次試驗，取平均值。

1.2統計學處理采用PASWStatistics18.0軟件進行統計分析，率的比較采用χ2檢驗，Westernblot、qRT-PCR及MTT結果采用GraphPadPrism6.0進行單因素方差分析及作圖，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1胰腺癌細胞株的Westernblot法檢測結果NDRG1（60kDa）在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW1990細胞株中均有表達，低分化細胞（PANC-1）中NDRG1蛋白水平表達較中分化（BXPC-3）及高分化細胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差異均有統計學意義（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.4，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=7.23，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=8.65，P<0.01）；MMP-7（28kD）在4種細胞株中表達與NDRG1的趨勢一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.5，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.27，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=10.58，P<0.01）。

2.2各細胞株的qRT-PCR檢測4組細胞株中NDRG1及MMP-7在mRNA水平均有表達，低分化細胞（PANC-1）中NDRG1在mRNA水平表達較中分化（BXPC-3）及高分化細胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差異均有統計學意義（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.15，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.35，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.95，P<0.01）；MMP-7的mRNA在4種細胞株中表達趨勢與NDRG1一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.27，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=8.66，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.17，P<0.01）。

2.3Westernblot及qRT-PCR對siNDRG1轉染效果的檢測Westernblot與qRT-PCR結果顯示，siNDRG1轉染組PANC-1細胞NDRG1蛋白與mRNA表達水平均明顯低于空白對照組（均P<0.05），但陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義（均P>0.05）（圖3）。

2.4siNDRG1轉染后MMP-7蛋白與mRNA表達變化Westernblot結果顯示，siNDRG1轉染組PANC-1細胞MMP-7蛋白與mRNA表達水平均明顯低于空白對照組（均P<0.05），但陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義（均P>0.05）（圖4）。2.5MTT檢測siNDRG1干擾后PANC-1細胞增殖變化空白對照組、siNDRG1轉染組與陰性對照組PANC-1細胞增殖率72h：（62.53±9.45）%、（42.26±10.24）%、（59.87±6.19）%；96h：（83.26±6.47）%、（51.39±11.29）%、（79.98±7.04）%；120h：（84.67±7.12）%、（61.57±4.38）%、（81.43±7.84）%。siNDRG1干擾后PANC-1細胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h與空白對照組比較，差異均具有統計學意義（t=9.454，P<0.01；t=12.367，P<0.01；t=3.733，P<0.05），而陰性對照組與空白對照組在各時間點差異均無統計學意義（均P>0.05）2.6流式細胞儀檢測siNDRG1干擾后PANC-1細胞調亡變化siNDRG1組、空白對照組、陰性對照組PANC-1細胞凋亡率分別為17.59%、0.45%、0.24%，siNDRG1組與陰性對照組或空白對照組比較，調亡率明顯增高，差異均有統計學意義（均P<0.05），陰性對照組或空白對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。

3討論

胰腺癌以發現晚、治療效果差、預后差及病死率高為特點。經多中心研究顯示，胰腺癌的1年生存率低于20%，5年生存率低于5%。80%以上的患者在確診時已經發生廣泛轉移。患者均死于癌腫惡性生長、轉移及浸潤。胰腺導管腺癌在胰腺癌病理分型中占80%~90%[11]。目前無論是手術、放療及化療均不能顯著提高患者的生存率。針對胰腺癌相關基因靶向治療是目前的研究熱點。胰腺癌的發生及發展是多基因的協同作用的結果。本研究顯示，在蛋白水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW19904組細胞株中均有表達，在低分化細胞PANC-1中NDRG1在蛋白水平表達較中分化BXPC-3及高分化細胞株CAPAN-2、SW1990中高，提示，NDRG1及MMP-7可能參與惡性腫瘤細胞的生長及分化行為，NDRG1及MMP-7表達上調會導致胰腺癌細胞分化程度差，惡性度增高。在mRNA水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1表達較BXPC-3及CAPAN-2、SW1990中高，提示NDRG1及MMP-7對胰腺癌細胞分化及惡性生長行為的調節在基因水平即已發生。NDRG1作為α/β水解酶，具有磷酸泛酰巰基乙胺序列，能夠活化氨基酸及脂肪酸，在細胞生長分化及細胞周期中起到重要作用，參與腫瘤細胞的蛋白水解代謝，從而促進腫瘤細胞的分化潛能，細胞周期從G1期向G2期轉化。NDRG1沒有水解酶的催化位點，受N-myc的抑制。NDRG1位于人染色體8q24，全長約60kb，包含著16個外顯子及15個內含子，C末端包含3段特有的具有10個親水性氨基酸殘基串聯重復序列。基質金屬蛋白酶作為蛋白水解酶家族，在腫瘤形成微環境中起到重要作用。

本研究采用siRNA轉染胰腺癌PANC-1細胞株，經Westernblot及qRT-PCR在蛋白及mRNA水平證明沉默效率達到60%以上，成功的下調了NDRG1在PAN-1細胞中的表達。NDRG1下調后，經Westernblot及qRT-PCR檢測發現，MMP-7在蛋白及mRNA水平表達下調[10]。NDRG1對惡性腫瘤生長分化等惡性行為的調控可能通過調控MMP-7表達實現，MMP-7可與NDRG1的輔基酰基載體蛋白結合形成復合體從而影響惡性腫瘤的行為，NDRG1也可能上調MMP-7表達從而通過水解活性促進胰腺癌細胞從原發灶脫落、遷移，在遠隔器官種植浸潤。MMP-7以酶原形式產生，激活后即形成IV型膠原酶，從而降解、破壞靠近腫瘤表面細胞外基質中I型、III型膠原，誘發腫瘤細胞沿缺失的基膜環形侵潤，結果即為惡性腫瘤細胞的侵襲轉移[18]。MMP-7可以與NDRG1的輔基酰基載體蛋白結合，兩者以復合體形式存在并激活，從而影響胰腺癌的生長分化、凋亡增殖等惡性行為。

MTT顯示，siNDRG1干擾后PANC-1細胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h均低于空白對照組，NDRG1表達下調后PANC-1細胞的增殖能力明顯受到抑制，流式細胞檢測也顯示，siNDRG1干擾后PANC-1細胞凋亡率升高，并以早期凋亡為主，NDRG1過表達可能抑制腫瘤細胞凋亡，對其進行敲除后胰腺癌細胞凋亡增加。NDRG1通過與靶基因3''''端非翻譯區的不完全配對抑制靶基因mRNA的翻譯或降解，從而參與細胞分化、增殖、發育、凋亡、代謝生物過程[19]。NDRG1對胰腺癌細胞增殖及凋亡的調控作用可能與對MMP-7表達的調控密切相關，需進一步實驗證明。本研究顯示，NDRG1表達上調對胰腺癌細胞的分化、增殖及凋亡具有調控作用。NDRG1對胰腺癌細胞的調控作用可能通過MMP-7表達實現。本研究可能為胰腺癌治療提供新的靶點，為胰腺癌的治療提供新的思路。

作者：張小薄高峰譚曉冬周磊王懷濤石剛單位：中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科遼寧省腫瘤醫院大腸外科