胃腺癌細(xì)胞論文范文

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1材料與方法

1．1方法

1．1．1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞株和SGC-7901/DDP培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(90%)和胎牛血清(10%)、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的混合培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃的溫箱培養(yǎng)。SGC-7901/DDP在無(wú)藥物培養(yǎng)基連續(xù)培育7d，然后將順鉑(終濃度800ng/ml)添加到SGC-7901/DDP的RPMI-1640培養(yǎng)基。2～3d進(jìn)行一次消化傳代，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1．1．2彗星實(shí)驗(yàn)(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901和SGC-7901/DDP細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)基制備成濃度為1×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率＞90%進(jìn)行SCGE。取110μl已熔化的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖澆注到全磨砂載玻片上，4℃固化10min后，依次加入10μl細(xì)胞懸液與75μl0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的混合液，4℃固化10min，固化后的玻片沉浸在細(xì)胞裂解液中，4℃避光裂解1h。PBS清洗載玻片后用堿性電泳液浸沒載玻片4℃避光解旋DNA20min。將電泳儀電壓維持25V，電流維持在0.3A，恒壓恒流4℃電泳25min，注意避光操作。然后用中和緩沖液(pH7.4)漂洗，用甲醇固定，滴加30μl濃度為20μg/ml的EB染液進(jìn)行染色。400倍熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)顯像，隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)視野拍攝30個(gè)細(xì)胞的SCGE檢測(cè)圖像，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次［2］。

1．1．3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察通過倒置顯微鏡下觀察SGC-7901和SGC-7901/DDP形態(tài)的不同，拍照記錄。

1．1．4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取狀態(tài)良好的人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP，胰蛋白酶消化，5×106個(gè)/ml制備接種到24孔板，5%CO2、37℃的溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后丟棄介質(zhì)，用滅菌槍頭借助無(wú)菌尺在每孔的底部中間劃一個(gè)“十”字傷口，用PBS輕輕清洗3遍，洗去懸浮的細(xì)胞，每孔加入2ml的無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于0、12、24h在交叉處拍照，利用Imageproplus軟件測(cè)量劃痕的間距，細(xì)胞劃痕遷移率(%)=(0h劃痕的間距－不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕間距)/0h劃痕的間距×100%，每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1．1．5MTT法檢測(cè)藥物的敏感性取狀態(tài)良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901/DDP，將濃度為7×104個(gè)/ml的細(xì)胞加入到96孔板中，每孔100μl體積，過夜培育。當(dāng)達(dá)到80%～90%細(xì)胞密度，加化療藥物干預(yù)，并設(shè)置不同濃度(以上每組3個(gè)平行孔)48h，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和無(wú)藥物孔。順鉑(0.03、0.3、3、30、60μg/ml)、5-氟尿嘧啶(0.1、1、10、100、200μg/ml)、依托泊苷(5、10、20、40、80μg/ml)、表阿霉素(0.01、0.1、1、10、100μg/ml)、多西紫杉醇(5、10、20、40、80μg/ml)、奧沙利鉑(5、50、100、200、400μg/ml)。在實(shí)驗(yàn)孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃培育4h，注意避光操作。結(jié)束培育，將上清液完全吸去，各孔加入DMSO150μl，振蕩15min，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫吸附法在570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔光密度值(opticaldensity，OD)，求3孔的平均值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對(duì)照組的OD平均值)×100%，同時(shí)計(jì)算出各類藥物的半數(shù)抑制率(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance，IC50)，細(xì)胞對(duì)不同藥物的耐藥倍數(shù)=SGC-7901/DDP對(duì)不同化療藥物的IC50/SGC-7901對(duì)化療藥物的IC50。

1．2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以珋x±s表示，單變量?jī)山M之間的比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2．1人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP的DNA損傷修復(fù)能力的差異SCGE的結(jié)果是利用CASP軟件分析尾長(zhǎng)作為DNA損傷與修復(fù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901和SGC-7901/DDP的彗星尾長(zhǎng)分別為29.71±4.45和20.38±3.48(t=16.67，P＜0.05)，見圖1、2。

2．2細(xì)胞形態(tài)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞顯微鏡下觀察為單層、形狀規(guī)則、大小均勻、高折射率、細(xì)胞邊界、核大、圓形或橢圓形;人胃癌SGC-7901/DDP細(xì)胞呈不規(guī)則、細(xì)胞大小不均一、多核、折光度低，見圖3。

2．3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用顯微鏡測(cè)量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901/DDP在0、12、24h細(xì)胞劃痕的寬度，結(jié)果顯示:SGC-7901細(xì)胞12、24h劃痕寬度比SGC-7901/DDP細(xì)胞劃痕寬度明顯縮小(F=77.12，P＜0.05)，SGC-7901的遷移能力比SGC-7901/DDP的遷移能力強(qiáng)，見圖4、5。

2．4胃腺癌SGC-7901/DDP對(duì)各類化療藥的敏感性人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901和SGC-7901/DDP對(duì)不同藥物的敏感性，順鉑、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、依托泊苷、多西紫杉醇對(duì)順鉑耐藥株及其親本細(xì)胞SGC-7901的IC50和耐藥倍數(shù)見表1，SGC-7901/DDP對(duì)順鉑耐藥的同時(shí)對(duì)表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奧沙利鉑也具有不同程度的耐藥。

3討論

目前已有大量的實(shí)驗(yàn)致力于對(duì)順鉑耐藥性的研究，其中DNA的損傷修復(fù)作用引起廣泛關(guān)注，核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair，NER)是DNA修復(fù)的重要途徑，核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excisionrepaircross-complementinggene1，ER-CC1)蛋白是順鉑誘導(dǎo)NER中的關(guān)鍵酶，ERCC1是可以識(shí)別DNA損傷和斷開鏈間交聯(lián)的功能，研究表明，ERCC1mRNA和蛋白的過表達(dá)使DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)與臨床胃癌患者順鉑化療療效呈負(fù)相關(guān)性。然而，目前對(duì)NER能力的檢測(cè)多用于臨床胃癌組織，無(wú)法反映腫瘤的生物學(xué)行為發(fā)生變化所導(dǎo)致的NER的變化，有學(xué)者提出外周血淋巴系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞攜帶有同源基因，均具有相同的NER系統(tǒng)。

本研究以人胃腺癌SGC-7901及其順鉑耐藥株SGC-7901/DDP作為研究對(duì)象，用SCGE的方法檢測(cè)在人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株和其順鉑耐藥株SGC-7901/DDP的DNA修復(fù)能力，結(jié)果顯示人胃腺癌SGC-7901/DDP較其親本細(xì)胞的DNA修復(fù)能力強(qiáng);此結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的DNA的修復(fù)能力與對(duì)順鉑的敏感性呈負(fù)相關(guān)，與臨床研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究在表明人胃腺癌SGC-7901順鉑耐藥后其DNA修復(fù)能力增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，用MTT的方法檢測(cè)SGC-7901順鉑耐藥株對(duì)其他化療藥物的敏感性是否發(fā)生變化，結(jié)果顯示SGC-7901/DDP對(duì)順鉑耐藥的同時(shí)對(duì)表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷等也具有不同程度的耐藥，可能由于表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西紫杉醇均通過與DNA作用而發(fā)揮細(xì)胞毒性，由于胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株的DNA修復(fù)能力增強(qiáng)，一定程度抑制其發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，并且有研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)順鉑積累的減少，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要原因，多藥耐藥基因1是編碼P糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multi-drugresist-ance-associatedprotein，MRP)的基因，P糖蛋白是一種跨膜蛋白，其通過ATP供能，將藥物泵出細(xì)胞;MRP也是一種能量依賴的運(yùn)輸?shù)鞍祝渲饕亲R(shí)別與谷胱甘肽形成MRP-1-ATP，自動(dòng)把藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而讓細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，藥物抵制腫瘤的影響削弱甚至消失，使細(xì)胞獲得耐藥性。本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示SGC-7901/DDP的遷移能力較正常的胃癌細(xì)胞株SGC-7901減弱，可能是順鉑進(jìn)入細(xì)胞后形成穩(wěn)定的Pt-DNA加合物，并且順鉑與金屬硫蛋白的穩(wěn)定結(jié)合使細(xì)胞黏附穩(wěn)定、不易軟化、較正常細(xì)胞株不易轉(zhuǎn)移。

作者：黃娜娜張逸寅顧康生單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科