卵巢癌細胞遷移侵襲探討范文

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1材料與方法

1．1實驗材料人卵巢透明細胞癌細胞ES-2購自上海中科院。pEGFP-C3-4．1N質粒和pEGFP-C3質粒由美國紐約血液中心Dr．XiuliAn惠贈。McCoy＇s5A培養基購自茂健聯星公司。FBS購自北京元亨金馬公司。Trizol、轉染試劑Li-pofectamine2000購自美國Invitrogen公司。G418購自美國默克公司。枸櫞酸抗原修復液、異丙醇、無水乙醇等購自鼎國生物公司。免疫組化二抗及DAB顯色試劑盒購自美國Dako公司。Transwell小室購自Corning公司。Matrigel膠購自美國BD公司。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白BCA定量檢測試劑盒、ECL發光液均購自普利來公司。人4．1N兔多克隆抗體由美國紐約血液中心實驗室惠贈?？功?actin鼠單克隆抗體、HRP標記羊抗兔(鼠)IgG二抗購自中杉金橋公司。Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin、Twist、Slug抗體購自美國Epitomics公司。FastQuantRTKit和SuperRealPreMixPlus均購自天根生物公司。

1．2方法

1．2．1免疫組化選取卵巢子宮內膜異位組織標本25例和卵巢透明細胞癌29例。切片常規脫蠟、抗原修復，3%雙氧水孵育，滴加兔抗人4．1N抗體，4℃過夜后TBS沖洗，滴加二抗，37℃孵育30min。TBS沖洗，DAB顯色。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察照相。4．1N免疫組化染色陽性結果為胞質內出現棕褐色顆粒或染色。切片均由2名有經驗的病理科醫師采用雙盲法評估算分。結果判定:采用半定量評分標準，在高倍鏡下與周圍間質相比，無著色記為0分，淺褐色記為1分，褐色記為2分，深褐色記為3分;陽性細胞百分率＜10%記1分，10%～80%記2分，＞80%記3分。兩者相乘為綜合染色強度評分。0～2分為表達缺失，3～6分為表達降低，9分為表達正常。

1．2．2細胞培養與轉染人卵巢癌細胞株ES-2常規培養于含10%胎牛血清的McCoy＇s5A培養液中，置37℃、5%CO2培養箱孵育。待貼壁生長24h、細胞融合度約90%時胰酶消化，按1×105細胞/ml重新接種至6孔板，培養18～24h后進行轉染。采用脂質體轉染試劑Lipofectamine2000將pEGFP-C3-4．1N質粒(4．1N組)和pEGFP-C3質粒(Con-trol組)分別轉染至細胞。轉染6h后，更換新培養基，37℃、5%CO2條件下，置培養箱培養。24h后加適當濃度G418篩選，7～10天后，半量G418篩選濃度維持培養，最終得到穩定轉染細胞株。以Westernblot和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測轉染效率。

1．2．3劃痕實驗觀察細胞的遷移能力穩定轉染細胞接種于6孔板，培養約24h。用10μl槍頭在6孔板底部輕劃形成劃痕，PBS洗去漂浮細胞并換成無血清培養液，置37℃、5%CO2孵箱培養。0、6、24h觀察拍照。用Image-J軟件隨機量取各圖的劃痕寬度3次，并計算遷移率:(0h劃痕寬度－6h/24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度。每組設置3個重復孔，實驗重復3次。

1．2．4Transwell遷移及侵襲實驗將基質膠用無血清的DMEM培養基1∶8稀釋，加Transwell小室濾膜內表面，20μl/室，37℃放置1h。將密度為5×104的細胞懸液200μl加至transwell上室，下室加600μl完全培養基。5%CO2、37℃培養箱孵育24h后取出。PBS沖洗膜，用棉簽將微孔膜上層的細胞擦去，下室用4%多聚甲醛固定10min，HE染色，鏡下隨機取6個不同視野計數移至微孔膜下層的細胞。實驗重復3次。

1．2．5qRT-PCR檢測4．1N、Claudin4、ZO-1、Twist、Slug、ZEB-2、MMP-2和MMP-3mRNA表達水平TRIzol提取細胞總RNA，按FastQuantRTKit說明進行逆轉錄合成cDNA。引物序列見表1。qRT-PCR反應按SuperRealPreMixPlus試劑盒說明配置體系并在iQ5Real-TimePCRDetectionSystem上運行。結果分析采用2－ΔΔCT方法，每組實驗重復3次。

1．2．6Westernblot法檢測4．1N、E-cadherin、N-cadherin、Vi-mentin和Twist蛋白的表達RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，計算上樣體積。根據目的蛋白的分子量選擇合適濃度的凝膠進行電泳。上樣于10%SDS-PAGE電泳分離后轉至硝酸纖維素膜，封閉2h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，加相應二抗，室溫孵育1h后TBST洗膜3遍，利用BioRadimagingsystem采用ECL發光顯影。

1．3統計學處理采用SPSS統計學軟件。采用GraphPadprism5對數據進行繪圖分析。采用Fisher精確檢驗，Wilcox-on秩和檢驗和t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．14．1N蛋白在卵巢透明細胞癌組織中表達下調免疫組化結果顯示，與異位子宮內膜相比，4．1N在卵巢透明細胞癌組織中表達顯著降低(12．96%vs46．30%，P＜0．0001)，見圖1。Westernblot結果顯示，轉染后，4．1N組中4．1N蛋白和mRNA水平較對照組顯著增高，差異有統計學意義(P＜0．0001)。

2．24．1N負性調控卵巢透明細胞癌細胞的遷移和侵襲能力與對照組(Control)相比，4．1N組癌細胞的水平遷移能力在劃痕6h及12h均明顯降低(P＜0．01)，癌細胞的遷移和侵襲能力均明顯受到抑制，差異均有統計學意義(遷移細胞數:(7．88±0．58)細胞/視野vs(16．75±1．19)細胞/視野，P＜0．0001，侵襲細胞數:(3．50±0．50)細胞/視野vs(6．25±0．67)細胞/視野，P=0．004)。見圖3、4。

2．34．1N對部分緊密連接蛋白、EMT轉錄因子和MMPs表達水平具有調控作用qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，4．1N組中緊密連接蛋白Clau-din-4(P=0．0013)和ZO-1(P=0．0015)的mRNA水平明顯上調，分別是對照組的2．36±0．05倍和18．75±0．68倍，Twist、Slug、ZEB-2mRNA、MMP-2和MMP-3mRNA明顯下調，分別是對照組0．53±0．04、0．37±0．00、0．45±0．06、0．68±0．06和0．71±0．11。Westernblot檢測結果顯示，4．1N組中Twist蛋白明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0．05)。見圖4。

3討論

本研究首次發現，4．1N蛋白在卵巢透明細胞癌中存在顯著性表達缺失，并能抑制透明細胞癌腫瘤細胞的體外遷移和侵襲能力。卵巢透明細胞癌易復發、出現化療耐藥及腹膜后淋巴結轉移是導致患者治療效果不佳和高死亡率的主要原因之一。Kur-man等［9］結合分子遺傳學和病理組織形態學，提出了卵巢癌細胞起源的新觀點，認為絕大多數看起來原發于卵巢的癌實際上起源于卵巢外組織，卵巢只是繼發受累部位;并且隨著組織學類型的不同，腫瘤細胞的起源與發病機制亦不相同，即卵巢腫瘤的發生存在異質性。近年研究表明，卵巢透明細胞癌與子宮內膜異位病灶密切相關，且越來越多的證據支持絕大部分子宮內膜異位癥是由經血倒流而產生的。我們有理由認為，透明細胞癌來源于子宮內膜(苗勒氏源性)并種植于卵巢，卵巢是繼發受累的［11］。此外，在子宮內膜異位癥患者在位內膜中，發現了包括癌基因通路激活等內在的分子異常，這些變化都使得子宮內膜組織得以種植播散到腹腔、卵巢表面成為可能。這也是我們實驗選取異位子宮內膜組織而沒有選取正常卵巢上皮的原因。相較于異位子宮內膜組織，卵巢透明細胞癌組織中4．1N的缺失說明了4．1N的潛在的抑癌作用。本研究利用細胞及分子生物學實驗手段首次發現，在卵巢透明細胞癌的演進中，尤其是腫瘤細胞的遷移與侵襲過程中，4．1N可能扮演著重要的負性調控角色。腫瘤轉移是一個復雜過程，往往需破壞細胞間連接、增強游走能力等。緊密連接位于上皮細胞和內皮細胞連接處，處于連接復合體的最頂端，在保持細胞極性以及協助信號傳導等過程中發揮重要作用，其組成包括Claudins、Occludins及ZO蛋白等。這些蛋白在腫瘤發生發展中的具體作用環節還有爭議，但緊密連接完整性的破壞可能是導致腫瘤細胞發生遷移的原因之一。Shang等發現，Clau-din-3和Claudin-4表達缺失的EOC病例往往預后不良。本研究結果顯示，4．1N可上調Claudin-4和ZO-1表達，從而至少部分解釋了生物學行為實驗中4．1N對腫瘤細胞遷移的抑制作用。腫瘤轉移過程中，涉及多種機制，包括EMT、失巢凋亡抵抗等。EMT能促進腫瘤細胞發生轉移，與患者的不良預后、化療耐藥及靶向治療耐藥均相關。除經典的cadherin-switch(即E-cadherin下調和N-cadherin上調)現象外，相關轉錄因子Twist、Slug及ZEB-2等也會被激活。預實驗結果顯示，在ES-2細胞中轉染4．1N后，E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達量都沒有出現明顯改變。本實驗雖未出現cad-herin-switch，但結果提示4．1N可能通過抑制Twist、Slug及ZEB-2表達進而調節下游分子從而發揮抑癌作用。Twist已被證實在很多腫瘤發展中起著關鍵性的作用，如抑制E-cadherin的表達和下調Claudin-4。本實驗結果顯示，4．1N過表達導致了Twist下調和Claudin-4上調，后者既可能是4．1N的直接調控結果，也可能是抑制Twist表達后的繼發改變。2013年GilMor研究小組發現，Twist1在EOC干細胞的分化和轉移中扮演著重要的角色，提示在卵巢癌中Twist的作用機制是多樣而豐富的，從而4．1N對其的干預進而產生效應也是多因素共同作用的結果。除Twist外，Slug對于E-cad-herin的下調進而促進腫瘤發展也具有重要作用，這一過程離不開PI3K/Akt信號通路的激活;反之，抑制PI3K/Akt信號通路能下調Slug進而阻止癌細胞的侵襲。4．1N也能通過與PIKE(PI3KinaseEnhancer)的相互作用來調節PI3Kinase。本組前期進行的蛋白質譜檢測，其結果也支持4．1N與PI3K之間潛在的作用關系。蛋白質譜結果提示過表達4．1N能上調多磷酸肌醇-5-磷酸酶的表達。磷酸肌醇-5-磷酸酶是一種PI3K相關的酶類，能促進細胞死亡，提示PI3K信號通路調節也可能是4．1N在抑制腫瘤演進中扮演一定的角色，但其具體的分子機制仍需進一步探究。侵襲是腫瘤演進過程的另一個重要環節。其中，MMPs能通過降解細胞外基質而對腫瘤細胞的游走能力進行正性調節，其中MMP-2在卵巢癌標本中的表達水平明顯高于卵巢漿液腺瘤且與臨床分期密切相關。本實驗顯示，4．1N對ES-2細胞侵襲能力的抑制，4．1N可能通過抑制MMP的表達水平，從而起到抑制腫瘤細胞侵襲的作用。綜上，4．1N蛋白參與負性調控卵巢透明細胞癌的演進，具體調控機制可能涉及對緊密連接蛋白、上皮-間質轉化轉錄因子和基質金屬蛋白酶的表達調控，從而為卵巢透明細胞癌的診治和預后判斷提供了新的線索和靶標。

作者：張樂天 任彩霞 安秀麗 劉從容 單位：北京大學醫學部基礎醫學院 病理系 解剖與組胚系 紅細胞生理實驗室，紐約血液中心 鄭州科技大學生物工程系