可抑制宮頸癌細胞的增殖范文

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摘要：目的探討HERC4對宮頸癌細胞生物學功能的影響及其分子機制。方法設計特異HERC4siRNA干擾序列，Lipofectamine2000法轉染Hela細胞，Westernblotting檢測轉染特異siRNA后Hela細胞HERC4蛋白的表達水平；CCK-8法檢測轉染后Hela細胞的增殖能力；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測轉染后Hela細胞凋亡率的變化；劃痕實驗檢測轉染后Hela細胞遷移能力。Westernblotting檢測轉染后Hela細胞CyclinD1、Bcl-2表達變化。結果轉染特異siRNA后Hela細胞HERC4蛋白表達量明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。與對照組相比，干擾組Hela細胞生長速度明顯減慢，細胞凋亡率增加，遷移能力明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。轉染后CyclinD1和Bcl-2在蛋白水平的表達顯著下調（P<0.01）。結論siRNA可有效降低宮頸癌Hela細胞中HERC4的表達，并通過抑制CyclinD1表達抑制宮頸癌Hela細胞的增殖和遷移能力，抑制Bcl-2表達增加細胞凋亡能力。

關鍵詞：HERC4；siRNA；Hela細胞；細胞增殖；細胞凋亡；細胞遷移

在世界范圍內，宮頸癌為女性第3大惡性腫瘤，且85%的新發及死亡病例均出現在發展中國家。近20年來，我國宮頸癌發病率和死亡率均明顯上升，且發病呈年輕化趨勢。預測宮頸癌的增殖、遷移能力，對了解病變的生物學特點、選擇正確的治療方案及預后判斷有著重要的意義。

宮頸癌的發生是遺傳和環境因素長期相互作用的結果，是涉及多基因改變和多階段致癌的復雜過程，國內外已有包括HPV癌蛋白E6、E7，染色體微結構穩定蛋白MCM-5、細胞周期蛋白CDC6、p16INK4A、鱗狀細胞癌抗原SCC、細胞增殖相關標志物如PCNA以及Ki-67等宮頸癌腫瘤標志物用于科研及臨床領域，對于提高疾病篩查率及臨床早期診斷具有非常重要的意義。

目前，研究發現泛素-蛋白酶體系統（ubiquitinproteasomesystem,UPS）在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。E3泛素連接酶通過參與底物識別和底物與泛素連接的作用，在蛋白酶體降解蛋白的底物特異性中起到決定性的作用。HERC4是近年來發現的E3泛素連接酶，有研究報道其在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁正常乳腺組織，且降低HERC4表達可對乳腺癌MCF-7細胞系的增殖產生抑制作用，將細胞阻滯在G1期。肺癌組織中HERC4的表達與乳腺癌的研究結果相同，而HERC4在宮頸癌中的表達情況及其功能研究在國內外尚無公開報道。本研究通過沉默宮頸癌Hela細胞中HERC4的表達，進一步檢測Hela細胞的增殖、凋亡和遷移能力的變化，從細胞水平闡明HERC4對宮頸癌細胞生物學行為的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑

胎牛血清、DMEM培養液、Opti-MEM培養液均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒、ECL（Electro-Chemi-Luminescence）化學發光液均購自碧云天生物有限公司，兔抗人HERC4，CyclinD1，Bcl-2多克隆抗體購自PLlaboratories，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自欣博盛生物科技有限公司，si-RNA由銳博生物有限公司合成，CCK-8試劑，AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidiumiodide,PI）細胞凋亡檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，PVDF（polyvinylidenefluoride）膜購自美國Millipore公司。

1.2細胞及細胞培養

宮頸癌Hela細胞由南方醫科大學基因工程研究所惠贈。Hela細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中恒溫恒濕培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3HERC4RNA干擾序列的設計

根據NCBI提供的序列（Genebank:XM_011539593）設計RNA干擾序列，經過BLAST分析，排除與其他基因同源的靶序列，共得到3條靶序列（表1），陰性對照siRNA序列為銳博公司專有。

1.4Lipofectamine2000法轉染Hela細胞

取對數生長期的Hela細胞接種于6孔板中，細胞濃度為5×105個/孔。每個孔加入約500μL無抗生素的培養基，當細胞融合度達到70%~80%時，參照Lipofectamine2000說明書的方法將各組siRNA分別轉染至Hela細胞中，終濃度達到100nmol，同時以未轉染的Hela細胞作為空白對照組（未加siRNA及轉染試劑），非特異性siRNA作為陰性對照組（NC組），每組設3個復孔。

1.5Westernblotting檢測轉染siRNA后Hela細胞HERC4，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達

收集轉染72h后的各組Hela細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度；取蛋白質40μg/孔進行10%SDS-PAGE電泳，將電泳分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉反應2h，分別加入抗人HERC4，CyclinD1和Bcl-2的兔源多克隆抗體（1∶1000，3%BSA）或抗人β-actin的鼠源單克隆抗體（1∶2000，3%BSA）于4℃孵育過夜；次日，TBST洗膜3次，每次5min后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（二抗，體積稀釋比例為1∶5000），室溫反應1h；TBST洗膜后，用ECL試劑進行顯影。使用CareStreamHealth公司的ImageStation4000RPRO成像儀檢測發光信號。

1.6CCK-8法檢測轉染siRNA后Hela細胞的增殖能力

將轉染24h后的各組Hela細胞按照5×103個/孔分別接種于96孔板中，每組設置5個復孔。將培養板置于細胞培養箱中，分別在細胞培養0，24，48和72h后加入CCK-8（10μL/孔），繼續培養1h，用酶聯免疫檢測儀檢測450nm波長處各孔的吸光度（A）值。以時間（T）為橫軸，以光吸收值（A）為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.7AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測轉染siRNA后Hela細胞凋亡的變化

將轉染72h后的各組Hela細胞以0.25%的胰蛋白••233酶（不含EDTA）消化收集，用PBS洗滌細胞2次后，加入500μLBindingBuffer懸浮細胞，再加入5μLAnnexinⅤ-FITC混勻，最后加入5μLPI混勻；室溫避光反應10min后，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.8細胞劃痕

實驗取處于對數生長期的細胞，消化后在6孔板中接種1×105個細胞，待細胞匯合度達到80%進行轉染。在單層細胞上，用10μL的槍頭沿培養板底部呈“一”字形劃痕，用PBS清洗掉懸浮的細胞，用不含血清的DMEM培養基繼續培養；分別在劃痕的0、12、24、48h給細胞更換新鮮的不含血清的DMEM培養基，顯微鏡下觀察細胞從劃痕處向中央爬行的面積，其面積大小表示細胞遷移能力強弱，拍攝后應用圖像分析軟件Image-J軟件計算細胞遷移面積，遷移面積（48h）=空白面積（0h）-空白面積（48h）。Migrationindex=遷移面積（48h）/空白面積（0h）。3次獨立實驗計算平均值。

作者：危敏1，張艷玲2，陳嵐1，蔡翠霞3，王涵多4單位：1.南山區婦幼保健院，2.廣州軍區總醫院婦產科，3.南方醫科大學基礎醫學院基因工程研究所

1.9統計分析

以SPSS13.0軟件進行統計學分析，所得數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗，P<0.05時認為差異有統計學意義。

2結果

2.1HERC4-si-3轉染可顯著下調Hela細胞中HERC4蛋白的表達應用Westernblotting分別檢測轉染HERC4-si-1、HERC4-si-2、HERC4-si-3組、陰性對照組和未轉染的空白對照組Hela細胞HERC4蛋白的表達。轉染HERC4-si-3組細胞HERC4蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組（P<0.01）。這一結果表明，HERC4-si-3轉染可顯著下調Hela細胞中HERC4蛋白的表達水平。

2.2HERC4表達下調可顯著抑制Hela細胞的增殖

采用CCK-8法檢測HERC4-si-3轉染組、陰性對照組和空白對照組Hela細胞的增殖情況。結果顯示，HERC4-si-3轉染組細胞的A值顯著低于陰性對照組和空白對照組細胞（P<0.01）。這一結果表明，下調HERC4的表達水平可顯著抑制Hela細胞的增殖。

2.3HERC4表達下調可促進Hela細胞的凋亡

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測HERC4-si-3轉染組、陰性對照組和空白對照組Hela細胞的凋亡率。結果顯示，HERC4-si-3轉染組Hela細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均高于陰性對照組和空白對照組細胞（P<0.01）。這一結果表明，下調HERC4的表達水平可促進Hela細胞的凋亡。

2.4HERC4表達下調可抑制Hela細胞的遷移

對轉染24h后的各實驗組及對照組細胞進行“一”劃痕，劃痕后的0h和48h在顯微鏡下拍照，劃痕區域的愈合情況可反映細胞的相對遷移能力。相較于陰性對照組和空白對照組，抑制HERC4表達后，Hela細胞的遷移能力明顯降低（P<0.01）；NC組與Mock組相比無統計學差異（P>0.05）。

2.5HERC4表達下調可抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達

應用Westernblot分別檢測轉染HERC4-si-3組、陰性對照組和未轉染的空白對照組Hela細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達。結果顯示，下調HERC4后細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達顯著降低。

3討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在其癌變、增殖、轉移、復發等一系列過程中伴隨著癌基因或抑癌基因變異，引起相關因子表達的紊亂，針對這些生物學特性，RNA干擾技術已成功應用于宮頸癌的基因治療與研究。通過載體攜帶化學合成的siRNAs，可通過細胞內RNAi體系使靶mRNA（如Bcl-2，cdk-2，mdm-2，pkc-α，tgf-β，H-ras，vegf和GFP的mRNA）沉默，組合不同的siRNAs可有效抑制癌細胞的增殖和生長。在宮頸癌中最新的研究發現針對HPVE6/E7癌基因的siRNA可顯著增加小鼠宮頸癌放療的效果；體內外研究表明通過全身給藥的方式靜脈輸入siRNA可抑制HPV相關宮頸癌細胞E6/E7癌基因的表達，并激活抑癌蛋白P53從而抑制腫瘤生長速度。

現有的研究證實UPS系統在腫瘤的發生中可起到關鍵作用，其成員不僅可以作為潛在的癌癥診斷標志物或者預后指標，而且可以作為潛在的分子治療靶標。該系統中的E3泛素連接酶因具有特異性而受到廣泛關注。HERC4是近年來才被鑒定出的一種E3泛素連接酶，其特點是具有HECT結構域和至少一個RCC1樣結構域。免疫熒光結果顯示HERC4定位于細胞的核內體和溶酶體中。HERC4在各種組織中廣泛表達，尤其在睪丸組織中大量表達，研究表明其在小鼠精子成熟過程中發揮重要作用。HERC4在不同乳腺腫瘤組織中（良性纖維瘤、導管內癌、浸潤性導管癌）的表達水平顯著高于對應的癌旁正常乳腺組織，且HERC4的表達水平越高，乳腺癌的惡性程度越高。在肺癌中的研究結果表明HERC4在肺神經內分泌癌、肺鱗狀上皮癌、肺腺癌中的表達水平均高于對應的癌旁正常肺組織，并且HERC4蛋白的表達情況與肺癌TNM分期、病理組織學分級相關。

但HERC4宮頸癌中的表達情況及其功能研究在國內外尚無研究報道，本研究通過轉染針對HERC4設計的特異siRNA，發現轉染HERC4-si-3后，Hela細胞中HERC4蛋白的表達水平顯著低于對照組。隨后，通過CCK-8法、細胞劃痕實驗和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法發現，下調HERC4的表達水平可顯著抑制Hela細胞的增殖、遷移并促進Hela細胞的凋亡，差異具有統計學意義。以上研究表明HERC4在宮頸癌細胞的增殖、凋亡和遷移中起著重要作用。

為了初步探討干擾HERC4表達對Hela細胞增殖和凋亡能力的影響機制，siRNA干擾下調HERC4水平后細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和Bcl-2的表達具有重要意義。CyclinD1作用于細胞周期的G1期，可與多種蛋白相互作用促進細胞進入S期，從而促進細胞的分裂與增殖。CyclinD1的過度表達與惡性腫瘤的發生、組織學類型、分化程度、侵襲性及患者預后存在密切關系。而定位于線粒體膜上的Bcl-2為公認的Bcl-2家族蛋白成員中主要抗凋亡分子。Bcl-2通過干擾細胞色素C及鈣離子的釋放，降低核酸內切酶活性，導致細胞色素C無法達到激活下游胱冬肽酶的閾值，從而保護細胞器功能，抑制細胞凋亡。本研究發現在Hela細胞中下調HERC4的表達，細胞周期素CyclinD1和細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達均明顯下降，進一步說明HERC4在宮頸癌的發生發展中可能通過促進CyclinD1和Bcl-2的表達促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過對HERC4在宮頸癌細胞中生物功能的研究，為HERC4參與宮頸癌發生的分子機制的研究以及宮頸癌靶向治療的研究提供了新的思路。通過進一步大量收集臨床資料齊全的樣本，分析HERC4作為宮頸癌分子診斷標志物以及治療靶標的可能，結合快速發展的RNAi技術治療腫瘤，將為宮頸癌的基因治療開辟更廣闊的前景。

作者：危敏1，張艷玲2，陳嵐3，蔡翠霞1，王涵多3 單位：1.深圳市南山區婦幼保健院，2.廣州軍區總醫院婦產科，3.南方醫科大學基礎醫學院基因工程研究所