膽管轉換的病理護理探究思考范文

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本文作者：李崇輝葉晟張愛群徐鴻濱潘可董家鴻黃志強單位：解放軍總醫院全軍肝膽外科研究所北京

不同原因引起的肝內外膽管梗阻可引起膽源性肝纖維化。過去20年對于肝纖維化的研究主要集中于肝星狀細胞(HSC)，活化的HSC可分泌纖維基質成分。近年來有研究提示，肝內膽管上皮細胞可通過上皮-間質表型轉變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)促進膽源性肝纖維化[1]。國外對原發性膽汁性肝硬變和原發性硬化性膽管炎病人的臨床病理標本進行研究，發現這些病人肝組織中，膽管細胞可表達Vimentin、FSP1和Snail等，并且與TGF-β信號通路的活化相關，特別是在伴隨膽小管增生時，但未發現肝細胞發生EMT[2-4]。本研究以經典的大鼠膽管結扎(bileductligation，BDL)后肝內膽汁淤積所致肝纖維化為模型，分析膽汁性肝纖維化時膽管上皮細胞發生EMT的特點。

材料和方法

1實驗動物和試劑雄性Wistar大鼠，質量200g左右，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。E-cadherin(H-108)兔多抗購自SantaCruz公司，抗Vimentin小鼠單抗購自Millpore公司，小鼠抗人CK19單抗(CloneMNF116)及α-SMA小鼠單抗購自Dako公司，兔抗人FSP1/S100A4多克隆抗體為Invitrogen公司分裝。其他免疫組化學及免疫熒光所用試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2模型制作大鼠經2%戊巴比妥鈉(50mg/kg，ip)麻醉，沿腹正中線切開，暴露膽總管，遠近端結扎后中間剪斷，關腹。假手術組僅開腹并游離膽總管后關腹。分別于術后1周和2周時將大鼠處死，取肝組織進行石蠟切片和冷凍切片。膽管結扎組每個時間點n=5，假手術組n=3。

3常規病理學觀察石蠟切片經HE染色，光鏡下觀察肝小葉、門管區的膽管增生、纖維化及炎癥細胞浸潤情況。

4免疫組化檢測將切片脫蠟，復水，3%H2O2處理10min，根據一抗說明書要求進行抗原修復。1%BSA-PBS封閉30min，加入稀釋后的一抗，于濕盒中室溫孵育2h或4℃過夜，PBS洗滌3次。然后加入Polymer-horseradishperoxidase(HRP)標記的二抗，室溫孵育1h。DAB顯色，蘇木素復染。光鏡下觀察棕黃色陽性信號的分布特點，以SONY三晶片高清晰CCD及Image-Pro軟件進行圖像采集。

5雙標記免疫熒光檢測冷凍組織切片經冷丙酮固定10min，PBS洗滌2次，1%BSA-PBS封閉30min。將切片同時與小鼠抗Vimentin單抗和兔抗E-cadherin多抗孵育，然后以不同熒光素標記的二抗檢測上皮細胞標志蛋白和間質細胞標志蛋白，即用TRITC-標記的山羊抗兔二抗和FITC-標記的山羊抗小鼠二抗同時孵育，DAPI染核，抗熒光衰減封片劑封片。尼康熒光顯微鏡觀察結果并照相。

結果

1HE染色膽管結扎組大鼠1周后耳、尾等部位皮膚黃染明顯，體重無明顯差異。假手術組大鼠肝臟顯示正常肝小葉結構，膽管結扎組術后1周匯管區膽管細胞增生，呈花環狀；2周時膽管增生范圍擴大，匯管區間質細胞明顯增多，發生纖維化(圖1)。部分匯管區炎細胞浸潤。膽管結扎組小葉內還可見局灶性肝細胞壞死區域。

2免疫組織化學染色CK19(Cytokeratin19)是膽管上皮細胞的標志性蛋白。假手術組大鼠肝組織小葉結構正常，每個匯管區含有2-5個棕染的膽小管。膽管結扎后1周，肝組織匯管區CK19陽性的小膽管樣上皮細胞明顯增多，常由3-5個陽性細胞組成花環樣細胞團，有些細胞團內可見小管腔。2周后呈陽性染色的膽管細胞數量增加更多，并向小葉內浸潤(圖2)。

3間質細胞標志免疫組化染色Vimentin和FSP1/S100A4是間質成纖維細胞的標志，α-SMA是間質肌成纖維細胞標志。假手術組大鼠肝組織Vimentin表達陰性，膽管結扎1周時，肝組織匯管區內新生膽小管Vimentin呈強陽性，2周時除膽管細胞陽性外，匯管區其他細胞也表達Vimentin(圖3)。假手術組大鼠肝組織內FSP1/S100A4陽性的細胞呈散在分布，可能為淋巴細胞和Kuffer細胞，膽管結扎1周和2周時的大鼠肝組織膽管細胞呈FSP1/S100A4中度陽性表達(圖4)。但是兩組大鼠膽管細胞均不表達肌成纖維細胞標志蛋白α-SMA，α-SMA陽性的細胞除動脈壁外，主要分布于匯管區，緊密包繞于膽管細胞周圍(圖5)。

4免疫熒光雙染膽管上皮細胞同時表達上皮細胞標志E-cadherin和間質細胞標志Vimentin(圖6)。

討論

從上皮細胞表型轉變為間質細胞表型的過程被稱作上皮-間質表型轉變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)[5]。而相反的轉變稱為間質-上皮轉變(MET)。EMT在胚胎發育過程中具有十分重要的地位，現在越來越多的數據表明該過程在調控正常人體組織和腫瘤組織的細胞可塑性方面也起到了關鍵作用。成熟上皮細胞發生EMT時，表現為上皮標志物，如細胞角蛋白(cytokeratin)、上皮鈣粘素(E-cadherin)和β-連環蛋白(β-catenin)等表達下調或丟失，出現間質細胞標志物，如波形蛋白(Vimentin)、纖維母細胞特異蛋白-1(fibroblastspecificprotein1，FSP1，又稱為S100A4)和平滑肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)等。

我們在膽管結扎誘導的膽源性肝纖維化大鼠模型中，發現門管區的膽管細胞不僅表達CK19，也表達間質細胞標志蛋白Vimentin和FSP1。波形蛋白是細胞骨架蛋白的一種，是間質來源細胞的標志蛋白，FSP1是早期成纖維細胞的關鍵標志蛋白，能夠通過與細胞骨架和p53蛋白的C末端反應而改變細胞的運動和生長。在EMT發生的起始階段，由于FSP1很快被誘導表達，可在原位鑒定到發生EMT的上皮細胞[6-7]。這些結果表明肝內膽汁淤積誘導膽汁性纖維化時，匯管區膽管在增生的同時，發生了向間質表型的轉變。由于間質表型細胞在功能上十分活躍，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增強，還可分泌多種細胞因子，通過自分泌或旁分泌的方式作用于鄰近細胞，以加速纖維化進程[6]。但是BDL大鼠膽管上皮并不表達α-SMA，可能是由于在體內EMT標志并不像在體外那樣所有的標志都能體現出來，例如I型膠原合成只在某些成纖維細胞亞群中表現出來，α-SMA只在肌成纖維細胞表達，而且FSP1+的細胞不表達α-SMA。

目前的研究還不能確定發生EMT的膽管細胞是通過直接轉化為纖維基質生成細胞，還是通過活化其他類型細胞間接參與肝纖維化。最近有研究[8]利用YFP和CK19標記的小鼠膽管細胞進行示蹤研究，發現肝纖維化時膽管細胞并未轉變成α-SMA陽性肌成纖維細胞或FSP1陽性成纖維細胞，但是該研究未檢測膽管細胞的Vimentin表達。研究還發現發生EMT的上皮細胞膠原合成增加，致纖維化因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)和促間質生長因子Hh(Hegehog)配體、PDGF-BB等分泌增加，因而可對門管區成纖維細胞起到促進作用。因此間質表型的膽管上皮細胞可能主要通過分泌細胞外基質和致纖維化因子促進其他間質細胞的增生。

膽管增生(膽小管反應)被認為在膽源性肝纖維化的啟動和發展中發揮至關重要的作用[9]。BDL大鼠中增生膽管細胞發生EMT，那么EMT和膽管細胞增生之間關系如何？膽管細胞增生受到許多因素的調節，如胃腸激素、膽酸、生長因子(如EGF、HGF)、血管生成因子(如VEGF)、神經營養因子和細胞因子(如IL-6)等均可刺激膽管細胞增生，這些因子與膽管細胞發生間質表型轉變的關系及分子機制有待于進一步深入研究。