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【摘要】植物體內(nèi)大量分布的微生物對(duì)植物產(chǎn)生的影響已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，特別是那些有益的影響可對(duì)植物的生長(zhǎng)及活性成分的形成產(chǎn)生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質(zhì)量一直是人們所關(guān)心的問題，甘草有益微生物對(duì)提高甘草的品質(zhì)有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進(jìn)展，以期對(duì)提高栽培甘草的質(zhì)量起到指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】甘草;內(nèi)生菌;根瘤菌;菌根真菌
甘草是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場(chǎng)需求量大。近年來，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對(duì)甘草資源的保護(hù)性利用及栽培甘草勢(shì)在必行。近年來，隨著人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質(zhì)量成為亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。相關(guān)研究表明，植物有益微生物可以產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，提高植物固氮性能，促進(jìn)植物對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡，保證寄主植物健康生長(zhǎng)。因此本文就近年來甘草有益微生物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對(duì)提高栽培甘草的質(zhì)量有指導(dǎo)意義。
1甘草內(nèi)生菌的研究現(xiàn)狀
內(nèi)生菌是指一生或至少一生中的某個(gè)階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并且不引起明顯組織變化的真菌或細(xì)菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］從短葉紅豆杉TaxusbrevifoliaNutt的樹皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae能產(chǎn)生紫杉醇，這一研究結(jié)果引起學(xué)者對(duì)內(nèi)生菌的廣泛興趣。目前，人們已經(jīng)從長(zhǎng)春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內(nèi)生菌，并取得了一些成果。
有學(xué)者對(duì)甘草內(nèi)生菌也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對(duì)甘草產(chǎn)生一系列作用。宋素琴等［4］對(duì)采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離，并純化得到149株細(xì)菌和2株真菌，鑒定得出149株細(xì)菌分屬于13個(gè)屬，2株真菌分屬于青霉菌屬Penicillium和鐮刀菌屬Fusarium。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌可通過拮抗病原菌促進(jìn)甘草生長(zhǎng)。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內(nèi)生細(xì)菌98株，并采用平板對(duì)峙方法篩選出6株菌株，其對(duì)植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、Paenibacillusehimensis。龔明福等［6］采用無菌操作技術(shù)從野生健康甘草Glycyrrhizauralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內(nèi)生細(xì)菌（Endophyticbacteria)125株，其中31株對(duì)棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)具有較強(qiáng)的拮抗活性，這31株內(nèi)生細(xì)菌分屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillussp.)、氣單胞菌屬(Aeromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonassp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)。另有研究發(fā)現(xiàn)，從甘草中分離的有些內(nèi)生菌還可產(chǎn)生活性物質(zhì)。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內(nèi)生菌，從中篩選出一個(gè)來自烏拉爾甘草的菌株Mesorhizobiumsp.CCNWGX022，從該菌株發(fā)酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內(nèi)酯Rhizobialide，是第一次從內(nèi)生菌中得到此類物質(zhì)。另有學(xué)者研究了內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量變化趨勢(shì)。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內(nèi)生細(xì)菌，研究阿拉爾地區(qū)豆科植物內(nèi)生細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內(nèi)生細(xì)菌的種類最多。內(nèi)生細(xì)菌種類的分布規(guī)律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長(zhǎng)期中總帶菌量平均值在各個(gè)月份變化趨勢(shì)不同，并且各個(gè)月份的帶菌量處于交替變化之中，說明不同月份5種豆科植物內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量不同，同種豆科植物不同組織部位的內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量有差異。
2甘草根瘤菌的研究現(xiàn)狀
根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌。這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養(yǎng)菌。目前有學(xué)者已經(jīng)從甘草中分離得到根瘤菌并進(jìn)行了一些相關(guān)研究。
目前對(duì)甘草根瘤菌的研究多體現(xiàn)在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過對(duì)西北干旱半干旱地區(qū)68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新類群和1個(gè)具有較高抗逆性的菌株。對(duì)新類群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035進(jìn)行16SrDNA全序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化研究。結(jié)果表明，CCNWGX022和CCNWGX035與中慢生根瘤菌屬內(nèi)參比菌株的16SrDNA相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數(shù)值分類、16SrDNAPCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對(duì)中國北方地區(qū)的甘草根瘤菌進(jìn)行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數(shù)值分類聚類分析中約85％的相似水平上產(chǎn)生2個(gè)表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16SrDNAPCR-RFLP分析表明，供試的20株菌共產(chǎn)生14種遺傳型，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。BOX-PCR指紋圖譜分析進(jìn)一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結(jié)論：在中國北方地區(qū)與甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium屬中均有分布。
3甘草菌根真菌的研究現(xiàn)狀
菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔(dān)子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態(tài)特征，這是真核生物之間實(shí)現(xiàn)共生關(guān)系的典型代表。根據(jù)形態(tài)和解剖學(xué)的特征，又把菌根分為外生菌根和內(nèi)生菌根兩大類。有學(xué)者對(duì)甘草菌根真菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)菌根真菌可促進(jìn)甘草的生長(zhǎng)。饒小莉等［11］分離了甘草的VA菌根，并用三葉草進(jìn)行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種了菌根真菌的甘草植株筆長(zhǎng)、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對(duì)照顯著增加，并且不同處理對(duì)植株生長(zhǎng)影響不同，得出結(jié)論接種VA菌根真菌顯著促進(jìn)了甘草的營養(yǎng)生長(zhǎng)。JingnanLiu等［12］用兩種AM菌根真菌Glomusmosseae與Glomusversiforme接種甘草，結(jié)果顯示接種的甘草相對(duì)于對(duì)照組在生長(zhǎng)的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對(duì)照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對(duì)降低了，由此得出結(jié)論接種AM菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價(jià)值的有效途徑。
4甘草其他微生物學(xué)相關(guān)研究現(xiàn)狀
近年來，對(duì)甘草微生物學(xué)轉(zhuǎn)化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，以光果甘草種子胚萌發(fā)形成的實(shí)生苗不同部位為外植體，成功誘導(dǎo)出光果甘草毛狀根，并利用TLDNA中rolC序列中的特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)光果甘草毛狀根進(jìn)行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對(duì)毛狀根轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的冠瘦堿進(jìn)行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實(shí)了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源Ri質(zhì)粒的T-DN段。燕飛等［14］利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601對(duì)藥用植物脹果甘草(GlycyrrhizainflatBat)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)其產(chǎn)生發(fā)根。在發(fā)根誘導(dǎo)過程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時(shí)間對(duì)脹果甘草子葉、胚軸進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，統(tǒng)計(jì)、比較各條件下的發(fā)根率，結(jié)果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8min時(shí)，發(fā)根誘導(dǎo)率最高,為56.49%。何晨等［15］用一株產(chǎn)β-葡糖醛酸酶的菌種HC-12對(duì)甘草進(jìn)行液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化。通過對(duì)菌種復(fù)合誘變以及應(yīng)用系統(tǒng)數(shù)值化及靈敏值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)優(yōu)化了發(fā)酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經(jīng)過柱層析及HPLC及1HNMR鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了發(fā)酵甘草于未發(fā)酵的生品對(duì)照甘草具有抗炎活性和鎮(zhèn)痛作用顯著性效果。
5小結(jié)
內(nèi)生菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：①內(nèi)生菌有促進(jìn)甘草生長(zhǎng)作用，內(nèi)生菌可與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而促進(jìn)甘草生長(zhǎng)。②有些內(nèi)生菌可產(chǎn)生活性物質(zhì)。③內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。另有研究表明，內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同的活性物質(zhì)［3］，王興紅［16］推測(cè)內(nèi)生真菌可能與中藥的道地性有密切的關(guān)系。這些成果對(duì)于甘草內(nèi)生菌的研究有重要意義。
根瘤菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：根瘤菌能夠通過與甘草共生，引起甘草根部或莖部結(jié)瘤，將空氣中的N2轉(zhuǎn)化為可吸收利用的NH4，從而為甘草提供氮素營養(yǎng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)。
菌根真菌對(duì)甘草的有益作用體現(xiàn)在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關(guān)系，它們之間可以交換各自所需的物質(zhì)，甘草借助菌根真菌吸收水分、養(yǎng)分和生長(zhǎng)促進(jìn)劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長(zhǎng)所需要的糖分和其它有機(jī)物。菌根真菌是根系的延長(zhǎng)和擴(kuò)展，且比根系吸收水分、養(yǎng)分的能力大得多，可促進(jìn)甘草的營養(yǎng)生長(zhǎng)，提高甘草的藥用價(jià)值。
微生物轉(zhuǎn)化對(duì)甘草的作用體現(xiàn)在：對(duì)甘草進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。
總之，微生物是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的資源，對(duì)甘草相關(guān)微生物進(jìn)行研究有重大意義，有利于提高甘草的質(zhì)量，對(duì)于中藥的可持續(xù)發(fā)展也將起到重大作用。新晨：
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