天山花楸葉中總黃酮范文

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【摘要】目的研究天山花楸中總黃酮最佳提取工藝。方法采用正交實驗，分別以比色法測定總黃酮提出率和高效液相色譜（HPLC）圖譜中總黃酮相對積分峰面積為指標，考察提取溫度、料液比、醇濃度對天山花楸葉中總黃酮提出率的影響。結果最終確定天山花楸葉中總黃酮的最佳提取條件為：溫度60℃，醇濃度為60％，料液比1∶10(g∶ml)，其中超聲功率60kHz，時間30min，在相同條件下連續提取兩次。結論該提取工藝合理，總黃酮提取率高，質量易于控制。

【關鍵詞】天山花楸；超聲提取；總黃酮；高效液相色譜圖譜；相對積分峰面積

天山花楸SorbustianshanicaRupr為薔薇科(Rosaceae)花楸屬植物(Sorbus)，系新疆維吾爾族和哈薩克族民間用藥，常用于治療肺結核、哮喘、咳嗽、胃痛等癥［1］。實驗研究表明天山花楸葉具有平喘鎮咳祛痰、依賴性地抑制心肌收縮和保護心肌缺血等作用［2］。本課題組藥效篩選實驗發現天山花楸中有效成分主要為黃酮類化合物。

天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能進入脂肪組織，是許多中草藥的有效成分，具有很高的藥用價值。黃酮類化合物具有消除疲勞、保護血管、預防動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、抗脂肪氧化、活化大腦及其他臟器細胞的功能［3］。藥理作用表現為抗炎鎮痛、抗病毒，抗輻射、抗癌抗腫瘤［4］，抗氧化、抗衰老、抗心腦血管疾病［5］，免疫調節、降血糖、治療骨質疏松等。傳統的黃酮提取方法有浸漬法、索氏法、回流法等，提取時間較長,并影響提出率。超聲提取是目前比較新的技術，超聲波產生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，都可加速藥物有效成分進入溶劑，從而提高了有效成分提出率,縮短了提取時間，節約了溶劑，并且避免了高溫對有效成分的影響［6］，因此把超聲技術用于中藥有效成分的提取越來越受到重視。

1材料

美國AgilentHP1100型高效液相色譜系統（配有：四元泵，紫外檢測器，HP1100化學工作站）；日本島津UV2401（PC）紫外光譜儀；德國SartoriusBP211D十萬分之一電子分析天平；SK5200HP超聲清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，磷酸、乙醇及其它試劑均為分析純；蘆丁對照品由中國藥品生物制品鑒定所提供；天山花楸供試品采自新疆瑪納斯林場，海拔2000～2500m，由石河子大學藥學院成玉懷高級實驗師鑒定為薔薇科(Rosaceae)花楸屬植物(Sorbus)。

2方法與結果

2.1亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測樣品中總黃酮含量蘆丁標準曲線的繪制:精密稱取蘆丁對照品20mg于50ml量瓶中，超聲溶解，用60％乙醇定容至刻度，搖勻備用。分別精密移取上述對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸鋁溶液1.0ml放置6min，加入5％氫氧化鈉試液10ml定容，放置15min后以試劑空白為參比溶液于510nm測吸光度。得回歸方程為：Y＝12.058X－0.0028，r＝0.9999，蘆丁在0.0162～0.0727mg/ml濃度范圍內呈良好線性關系。其平均加樣回收率為98.0％；RSD(n=3)為0.95%。

2.2HPLC分析

2.2.1色譜條件WatersC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；檢測波長360nm；溫度25℃；運行時間30min；平衡時間10min；進樣量20μl，梯度洗脫條件見表1。表1HPLC梯度條件（略）

2.2.2HPLC圖譜在上述HPLC色譜條件下，樣品中各組分的色譜峰分離度良好。結果見圖1。

2.2.3HPLC分析指標建立本課題組藥理實驗證明，醋酸乙酯提取物為藥理實驗有效部位。經理化鑒定及TLC分析結果顯示該有效部位呈黃酮類化合物陽性反應。通過對比圖1中各樣品HPLC圖譜，在20～30min其共有峰保留時間和整體圖貌具有良好的一致性。色譜分析中，化合物保留時間，取決于化合物特定的色譜行為，可以確定20～30min一系列色譜峰為黃酮類化合物色譜峰。因此，本實驗選擇積分HPLC圖譜20～30min各組分色譜峰，計算相對積分峰面積（各組分積分峰面之和與樣品質量的比值，記作：A/μg），對指標進行量化，并以此分析樣品。

2.3正交實驗設計結合預實驗實際情況，選提取溫度（A）、料液比（B）和乙醇濃度（C）為影響總黃酮提出的主要因素，每個因素取3個水平（見表2），選用L9（34）正交實驗表安排實驗，其中超聲功率60kHz，時間30min，連續提取兩次。精確稱取天山花楸葉干粉2.0g，加入不同溶劑系統，平行提取條件下操作，按“2.1”項測定并計算總黃酮含量及相對積分峰面積。

表2因素水平

2.4正交實驗結果及分析

由表3～4結果分析表明，以總黃酮含量為指標時，因素A對總黃酮提取實驗影響顯著，影響順序為A>B>C，最佳提取工藝條件為A2B3C3；由表3，表5分析表明，以HPLC圖譜相對積分峰面積為指標時，因素A、C對總黃酮提取實驗影響顯著，影響順序為A>C>B，最佳提取工藝條件為A3B1C2。表3結果與極差分析（略）表4總黃酮含量為指標方差分析（略）表5相對積分峰面積為指標方差分析（略）

2.5最佳工藝條件驗證實驗通過以上實驗，綜合分析考慮，最終選用相對積分峰面積為指標，最佳提取工藝條件確定為A3B2C2，即提取溫度為60℃，料液比為1/10g/ml，乙醇濃度為60％，其中超聲功率60Hz，時間30min，連續提取兩次。在此最佳工藝條件下平行進行3次實驗，總黃酮提取率較高且穩定。

3討論

3.1浸提溶劑的選擇

黃酮類化合物的游離黃酮苷元和黃酮苷極性皆較大，因此較易溶于極性較大甲醇和乙醇以及相應的水溶液中，提出率較高；而醋酸乙酯和丙酮極性較小，相對提出率較低。乙醇相對甲醇而言毒性小，且本身具有殺菌作用，提取樣品不易發霉變質，所以本實驗選取乙醇為提取溶劑。

3.2檢測波長的確定

精密移取蘆丁對照品溶液2.0ml于25ml量瓶中加60％乙醇至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml放置6min，加入8%硝酸鋁溶液1.0ml放置6min，加入5％氫氧化鈉試液10ml定容，放置15min后于400～800nm波長范圍進行紫外掃描。結果表明，蘆丁顯色后在510nm處有最大吸收峰。

3.3顯色條件考察

在預實驗中參考有關文獻的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量時，發現短時間內樣品吸光度值變化較大，準確度、精密度、重現性及回收率結果均較差。故本實驗又重新考察了顯色劑加入量、顯色溫度和顯色時間，對比色條件進行了改進，確立了新的測定條件，即“2.1”項中測樣品中總黃酮含量的方法。經重復性、回收率等實驗分析表明，以此方法測定天山花楸中總黃酮含量，能夠取得較為滿意的結果。

3.4分析指標的確定

本實驗以蘆丁為對照品加入顯色劑于400～800nm波長范圍內掃描，其在510nm具有最大吸收，主要原因是其具有鄰二酚羥基可與顯色劑顯色。但天山花楸葉醇提液中，除含有黃酮類化合物，綠原酸含量也較高［7］。綠原酸也具有鄰二酚羥基可與顯色劑顯色，對天山花楸葉中總黃酮含量測定產生干擾［8］。實驗表明以蘆丁為對照品，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑，在510nm測定天山花楸葉醇提液中總黃酮含量的方法專屬性不強、有局限性、準確性較差。而HPLC圖譜顯示，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，可以避免樣品中其它組分干擾目標化合物的分析，專屬性較強。且經初步實驗驗證20～30min為一系列黃酮類化合物的色譜峰。因此，本實驗選擇以HPLC圖譜20～30min相對積分峰面積為指標來分析天山花楸葉提取樣品。

3.5最佳工藝條件的確定

通過實驗，以HPLC圖譜中總黃酮相對積分峰面積為指標，確定了天山花楸葉中總黃酮的最佳提取工藝條件，其中料液比為1/8g·ml-1。但考慮到干燥花楸葉粉末吸水性較大，影響樣品流動性，不利于循環超聲提取，且由表5可知，料液比對總黃酮的提取無顯著性影響，綜合分析考慮將料液比確定為1/10g·ml-1。

3.6結論

與比色法測定總黃酮含量為指標相比，以HPLC圖譜中黃酮類化合物相對積分峰面積為指標對樣品的分析方法具有專屬性強、準確度高、重復性好等特點，易于生藥及制劑質量控制。以其確定的天山花楸葉總黃酮提取工藝合理，提取率穩定。新晨：

【參考文獻】

［1］新疆自治區衛生廳，新疆中草藥編寫組.新疆中草藥［M］．烏魯木齊：新疆人民出版社，1975：92.

［2］于明，李銑．花楸屬植物化學成分藥理作用及其研究進展［J］．遼寧中醫學院學報，2004，6(5)：364.

［3］肖坤福，廖曉峰．黃酮類化合物研究進展及應用［J］．食品研究與開發，2003，24(4)：13.

［4］YoshizawaY,KawaiiS,UrashimaM,etal．Differentiation-inducingeffectsofsmallfruitjuicesonHL-60leukemiccells［J］．JAgricFoodChem,2000,48(8):3177.

［5］TermentziA,KefalasP,KokkalouE．AntioxidantactivitiesofvariousextractsandfractionsofSorbusdomesticafruitsatdifferentmaturitystages［J］．Foodchemistry,2006,98(4):599.

［6］李苑，張敏．中草藥中黃酮類化合物提取工藝的研究概況［J］．廣東藥學，1999，(9)：4.

［7］張芹，李鵬，唐輝，等．高效液相法測定天山花楸中的綠原酸含量［J］．時珍國醫國藥，2008，19（1）：59.

［8］張芹，李鵬，唐輝，等．天山花楸中總黃酮和槲皮素測定［J］．石河子大學學報，2006，24（6）：709.