聚氨基酸載體研究進展范文
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現代藥物傳遞系統的研究離不開新型材料的使用,特別是藥用高分子材料,殼聚糖、透明質酸、明膠、淀粉、海藻酸鈉、白蛋白、纖維素、聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸類、聚酯、聚醚類等已在藥劑學中展現出獨特的優勢。但生物相容性、生物降解性和安全性制約了部分藥用高分子材料的使用,開發安全的且具有新型功能的高分子材料一直是藥劑學研究的熱點領域。氨基酸是生物功能大分子蛋白質的基本組成單位,是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。選用一種或多種氨基酸合成聚合物能在體內酶的作用下降解為氨基酸,生物相容性好,且安全無毒,聚氨基酸的研究已受到廣泛的關注。采用天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸等制備聚氨基酸是一類低毒、生物相容性好、容易被機體吸收、代謝的生物降解高分子,在醫藥領域如藥物控釋、人造皮膚等方面具有廣泛的應用。目前聚氨基酸作為藥物載體的研究主要集中在聚氨基酸-藥物偶聯物、聚氨基酸復合載體、氨基酸共聚物幾個方面:聚氨基酸與藥物通過化學鍵形成偶聯物,在體內酸性環境及酶的作用下化學鍵斷裂釋放藥物,達到緩釋、靶向的作用,并且可以降低藥物的毒性;聚氨基酸與其他高分子材料形成復合載體以克服單一材料的不足以及實現新的功能;氨基酸共聚物亦可形成兩親性材料作為藥物載體,以提高藥物溶解性能,延長體內循環時間和實現靶向目的。
1聚氨基酸-藥物偶聯物
聚氨基酸含有活性氨基和羧基端,可以通過共價鍵與藥物結合,形成偶聯物,該偶聯物在體內特定酸性環境及酶的作用下化學鍵斷裂釋放藥物,達到緩釋、靶向的作用,同時由于聚氨基酸的保護作用,能夠提高藥物的穩定性,降低藥物的毒性。聚氨基酸-藥物偶聯物研究起始于上世紀70年代初,美國猶他大學Kim領導的課題組曾成功地合成了聚谷氨酸材料,用氨基丙醇為側鏈基,以共價結合方式與甾體避孕藥炔諾酮形成偶聯物,并進行了體外及大鼠體內釋放試驗,其釋藥時間達300余天。實驗結果表明,聚谷氨酸可降解為單體并不在生物體內滯留。聚氨基酸含有活性羧基與藥物通過酯鍵結合是較為常見。另外聚氨基酸還可以通過腙鍵與藥物相連,因為腙鍵在低pH環境下時容易斷裂,在腫瘤低pH環境下靶向釋放。聚氨基酸與順鉑通過配位鍵結合或與生物藥物結合可延長體內循環時間。但由于該類載體是通過藥物與聚氨基酸共價鍵偶聯,針對每一藥物都需要設計合適的反應條件,并完成聚氨基酸-藥物偶聯物的制備,增加了實施的難度、提高了成本,因此在應用上受到限制。
1·1通過酯鍵結合
陳汐敏等[1]制備了新型天冬氨酸-谷氨酸共聚物-甲硝唑納米粒,粒徑為198·9nm,載藥量達12%,1h與24h體外累積釋放百分率分別為12·19%和47·51%。戚曉紅等[2]制備了聚天冬氨酸-甲硝唑納米粒,平均粒徑為404·8nm,載藥量高達30%,24h體外累積釋放百分率為38·01%,并能持續釋放達30d,研究結果表明,聚天冬氨酸-甲硝唑納米粒顯著提高甲硝唑對滴蟲的抑殺作用。因此,聚天冬氨酸是一種非常有潛力的載體。
1·2通過腙鍵結合
研究表明腫瘤組織pH低于正常組織,而腫瘤細胞內更是偏酸性,內含體和溶酶體pH低至5·0,利用pH的不同設計pH敏感給藥系統可以達到靶向的目的。Ponta等[3]將PEG-Pasp[poly(ethyleneglycol)-poly(asparticacid)]共聚物的天冬氨酸羧基與氨基乙酸甲酯或4-氨基苯甲酸甲酯的氨基反應再與肼反應后與阿霉素分子的羰基通過腙鍵共價鍵鏈接(腙鍵在弱酸環境易于解離),研究表明,不同相對分子質量比的氨基乙酸甲酯鏈接的聚合物PEG-Pasp在pH5·0條件下藥物釋放均明顯快于pH7·4,如PEG與Pasp相對分子質量比為12∶5,PEG相對分子質量為12kD時,測定48h,pH7·4時藥物釋放30%,pH5·0釋放40%。因此,該釋藥體系可使Dox在低pH條件下快速釋放而聚集于腫瘤部位。
1·3通過配位鍵結合
聚氨基酸與含金屬元素藥物之間通過配位鍵結合,在體內緩慢釋放,延長其體內循環時間。如NC-6004[4]為PEG-聚谷氨酸共聚物與順鉑的配位化合物,聚谷氨酸側鏈羧基通過配位反應取代順鉑中氯原子后與鉑原子結合,順鉑從NC-6004中24h和96h分別釋放19·6%和47·8%,體內維持較長時間血藥濃度,體內AUC0-t和cmax分別是順鉑的65倍和8倍。
1·4基因融合
簡單的多肽鏈可以形成與PEG類似的空間伸展構像,將蛋白與多肽鏈融合,可以起到穩定蛋白的作用。多肽不僅比PEG能夠提供更均勻同源終端產物、避免生產過程中PEG的化學鏈接,而且多肽的長度可以根據調整半衰期的需要精確調控。Schellenberger等[5]采用丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸制備多肽36氨基酸片斷組成氨基酸隨機序列文庫,最終根據遺傳學穩定性、溶解性、熱穩定性、抗聚集性、以及雜質(宿主細胞蛋白、DNA、脂多糖)的多少,篩選出一種由864個氨基酸組成的多肽,將該多肽融合到新型降糖藥Exenatide上,使其體內半衰期由原來的2·4h延長至139h。
2聚氨基酸復合載體
聚氨基酸與常用高分子材料通過化學鍵或物理作用結合形成復合載體,可以實現緩釋、靶向、降低毒性、提高基因藥物的轉染率的目的。PEG與疏水性聚氨基酸形成兩親性聚合物,在溶液中可自動聚集成膠束,作為藥物載體;聚賴氨酸帶正電荷,與帶負電荷的基因藥物形成復合物,可提高載藥量和轉染效率,接上相應配體可以實現靶向目的;亦可選擇合適聚氨基酸與陽離子材料殼聚糖通過電荷作用形成復合載體。聚氨基酸為兩性離子,在不同pH條件下結構不同,親水性能也不同,可與聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成pH敏感復合載體。另外,親水性氨基酸有類似PEG的性能,用以修飾其他材料后形成復合載體以達到長循環作用。該類載體在應用時存在如下幾個方面問題:1)合成復合載體增加成本,如PEG與氨基酸組成復合載體,首先要將PEG的端基活化為氨基、羧基等活性基團,增加了生產工序;2)復合載體增大安全性風險:高分子材料如聚乙二醇、殼聚糖、聚乳酸等存在一定的免疫原性,聯合聚氨酸后可能增強免疫原型;3)復合載體的載藥性和降解性有待研究。因而這類載體目前尚未見產品面世。
2·1聚氨基酸與PEG組成復合載體
聚乙二醇(PEG)具有柔韌的親水性長鏈結構,又可生物降解,利用PEG親水性強,分子鏈柔性,能夠包裹在聚合物膠束、脂質體或納米粒等表面,從而使微粒給藥制劑避開單核吞噬細胞的吞噬,達到長循環作用。利用聚氨基酸所帶電荷不同、聚氨基酸的殘基親水性不同與PEG偶聯后以達到提高載藥量、緩釋、降低毒性或制備成pH敏感型載體。
Prompruk等[6]以PEG為親水段,天冬氨酸與苯丙氨酸(Phenylalanine)合成的聚合物作為疏水段,形成嵌段共聚物。天冬氨酸可以通過離子作用包載藥物,而苯丙氨酸的疏水性或者芳環相互作用有利于膠束形成,減緩膠束解離,延緩藥物的釋放。制備的PEG-P(asp-phe)(相對分子質量比5∶6∶4)包載親水性藥物三氮脒,4h內釋放35%,并可維持12h緩釋。
Wang等[7]合成mPEG與聚N-氨基酸基-DL-天冬酰胺接枝共聚物制備納米膠束,用于包載藥物順鉑,結果可維持40h緩慢釋放,并且可降低對Bel-7402細胞的毒性。選用帶正電荷的賴氨酸(lysine)包載基因藥物,以提高包封率和轉染效率等是聚氨基酸應用研究熱點之一。Park等[8]研究PEG接枝或共聚L-賴氨酸(polyL-lysine,PLL)后通過物理吸附包裹在腺病毒表面,由于血清蛋白表現負電性,可通過離子交換作用使PLL-g-PEG去PEG化,而藥物釋放腺病毒,再通過CAR中介的細胞內吞作用進入細胞,結果包裹的腺病毒相對表達水平最高達370%。因此,可以通過簡單的物理包裹病毒,以提高轉染率,減少先天免疫反應。
Choi等[9]制備PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)載質粒DNA復合物,轉染效率是聚賴氨酸的80倍,細胞毒性試驗結果顯示,使用PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)細胞存活率達95%,而使用聚賴氨酸或者聚乙烯亞胺的細胞存活率分別為65%和55%。
采用聚氨基酸與PEG共聚作為抗腫瘤藥物載體有NK012[10]已進行Ⅰ期臨床研究,NK105已進行Ⅱ期臨床研究[11]。NK105為PEG-聚天冬氨酸共聚物,通過疏水作用物理包裹紫杉醇,注射后血漿藥物濃度可以維持72h,而單用紫杉醇24h后就已經檢測不出;用藥后5min血藥濃度及AUC分別是紫杉醇的11~20倍和50~86倍;臨床應用膠束(相當于紫杉醇25mg/kg)抗腫瘤活性與100mg/kg紫杉醇療效相當。NK012為PEG-聚谷氨酸共聚物包載7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxy-CPT,SN-38),單用SN-38注射后濃度呈對數式速度下降,而HT-29腫瘤中使用NK102SN-38的清除率顯著降低,SN-38濃度維持在30ng/g長達168h,并且NK102在小鼠體內的網狀內皮系統表現高度聚集。
2·2與相應配體結合
聚氨基酸-PEG與相應配體結合可以實現靶向的目的。Kim等[12]制備聚賴氨酸-PEG兩親性嵌段共聚物,并以葉酸(folicacid,FOL)修飾PEG,形成帶正電PLL-PEG-FOL聚合物,帶負電熒光標記的牛血清白蛋白(FITC-BSA)與PLL-PEG-FOL形成聚電解質復合物,應用于葉酸受體過表達KB細胞,該體系FITC-BSA表現出高攝取,結果證實提高攝取是由葉酸受體產生的。試驗者采用葉酸受體缺乏細胞A549研究表明,PLL-PEG-FOL/FITC-BSA攝取量并未增加,因此證實該給藥體系可以通過葉酸受體達到靶向的目的。
Liu等[13]采用樹狀接枝聚賴氨酸-PEG-30肽(DGL-PEG-Leptin30,Leptin是內源激素衍生物,作為腦靶向配體)與血漿DNA制備納米粒,運載基因藥物穿過血-腦脊液屏障達到腦靶向作用。研究表明,DGL-PEG-Leptin30在體外實驗中能夠穿越血-腦脊液屏障模型,而靜脈注射后可以在小鼠的腦內聚集。總之,DGL-PEG-leptin30/DNA是相當安全有效的腦靶向基因傳遞系統。
2·3與殼聚糖形成復合載體
殼聚糖是由自然界廣泛存在的幾丁質經過脫乙酰作用得到的陽離子聚多糖,而氨基酸表現為兩性離子,在生理條件下,不同氨基酸可表現為陽離子型或陰離子型,選擇合適氨基酸能與殼聚糖通過靜電作用形成分子間聚合物。Shu等[14]制備水溶性殼聚糖(water-solublechitosan,WSC)聚天冬氨酸-PEG復合物(WSC/Pasp-PEG),包載牛血清白蛋白,載藥量最大可達40%左右,包封率最大90%左右。模擬體內環境pH1·2、2·5和7·4條件下體外藥物釋放研究,釋放速度pH7·4>pH1·2>pH2·5,這是因為pH1·2時Pasp的羧基以-COOH形式存在,WSC與Pasp之間的靜電作用力減弱,復合物不穩定,破裂后藥物釋放。在pH7·4時WSC的去離子化,導致納米粒崩塌,藥物快速釋放;空腹胃內pH(pH2·5)時,藥物緩慢釋放。因此,建議餐前服用。
2·4與聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成復合載體
聚乳酸-羥基乙酸共聚物也是藥劑學中常用高分子材料,常作制備微球的材料。Yang等[15]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚谷氨酸共聚(PLGA-b-PGA),制備成pH敏感聚合物,在pH3~9范圍內,隨著pH升高,該聚合物依次呈紊亂形態(pH3)、膠束(pH5)、伴有厚壁的半囊泡(pH7)、囊泡(pH9),因此,可以通過環境pH改變控制藥物釋放。
2·5與聚乙酰亞胺形成復合載體
聚乙烯亞胺富含氨基,可與DNA鏈上負電性的磷酸根通過靜電作用締合成復合物,在此過程中,DNA會被高度壓縮成50~200nm大小的納米球,大大增強了對細胞膜的穿透作用,因此具有較高的轉染效率,是目前研究較多的聚陽離子型基因載體。陳丹等[16]以天冬氨酸、谷氨酸為單體,經過聚合后作為母體骨架,將低分子聚乙酰亞胺偶合于母體上,作為DNA藥物的載體,轉染效率是聚乙酰亞胺的兩倍,并且體外細胞毒性并沒有增加。
2·6聚氨基酸作為親水修飾材料應用
雖然PEG通常被用來作為親水性修飾材料,但PEG修飾的過程增加了制劑的成本和產生了雜質[17-18],PEG修飾后在動物模型反復用藥后表現出腎小管空泡,而且PEG的空間位阻限制了載體的細胞攝取。另外,應用PEG后在動物和人體也會產生抗體[19]。因此,研究人員嘗試采用親水性氨基酸來代替PEG。
Romberg等[20]分別用摩爾分數為5%的聚羥乙基L-天冬酰胺[poly(hydroxyethylL-asparagine,PHEA,相對分子質量3kD]、聚羥乙基L-谷氨酰胺[poly(hydroxyethylL-gluta-mine),PHEG,相對分子質量4kD]修飾脂質體,并比較其半衰期,未包裹脂質體半衰期9·7h,用聚天冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂質體半衰期分別為14·4h和11·9h。組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E都能使PHEA和PHEG降解,并且修飾后脂質體體外激活補體能力大大降低,PHEA修飾的脂質體激活程度小于PHEG修飾的脂質體。
Romberg等[21]隨后驗證了聚(羥乙基L-谷氨酰胺)-N-琥珀雙十八烷基胺包裹脂質體,能夠對以二油酸磷脂為主要組成的脂質體起穩定作用,并且由于脂質體外層包裹的聚氨基酸脫落可以控制藥物釋放。
Schlapschy等[22]證明通過聚氨基酸修飾HER-2抗體Fab段4D5,可以顯著延長體內循環時間。4D5半衰期僅為0·5h左右,而采用甘氨酸豐富的均聚氨基酸(Gly4Ser)n100或200個重復單元修飾4D5后,其半衰期分別為2·1h和5·7h。
以上研究表明,采用親水性氨基酸同樣可以達到長循環作用,從而避免了PEG的不良反應。
3氨基酸共聚物
采用一種或幾種氨基酸合成聚合物作為藥物載體,其代謝產物對人體無毒,比其他高分子材料具有更高的安全性,氨基酸來源豐富,價格便宜,組成人體氨基酸有20種,可以根據需要選擇,滿足不同藥物載體的需要,聚氨基酸分子鏈上具有很多活性基團(如:氨基、羧基),藥物或活性物質能方便與之結合,因此聚氨基酸作為藥物載體也越來越受到關注。聚氨基酸作為藥物載體在應用時應該注意:
1)聚氨基酸在體內降解為氨基酸,要注意克服由此帶來的不良反應,如患有苯丙酮尿癥病人不宜使用含苯丙氨酸的載體;2)氨基酸在一定條件下帶有電荷,選用帶不同電荷的氨基酸制備藥物載體要防止由于電荷吸引而導致的載體的聚集;3)氨基酸形成聚合物聚合度高時會出現溶解性問題。
韓亞冬等[23]以聚L-谷氨酸為載體材料,采用無水乳液法制備口服胰島素微球,微球直徑在5~20μm,載藥質量分數為5%~9%。載藥微球具有良好的pH敏感釋放行為,在胃模擬液中2h釋放量約為5%,在腸道模擬液中2h釋放90%以上,因此,可以使胰島素靶向于腸道釋放,避免胃酸對胰島素的破壞。
Akagi等[24]以相對分子質量為300kD的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)與L-苯丙氨酸乙酯接枝共聚,并采用水溶性碳二亞胺將卵清蛋白固化至γ-PGA納米粒上或將卵清蛋白包裹制備納米粒。L-苯丙氨酸乙酯與卵清蛋白疏水區域之間通過疏水作用,該載體37℃,pH7·4條件下10d的釋放量不超過5%。體外細胞毒性試驗結果表明,該納米粒對HL-60細胞無任何毒性,具有生物降解性和生物相容性,能調節分布和細胞特異性傳遞,有望作為蛋白類藥物載體。Kima等[25]以L-谷氨酸γ-芐酯與L-苯丙氨酸合成嵌段供聚物,經脫去芐酯后形成兩親性共聚物制備泡囊,有望作為藥物載體。
Du等[26]證實同服聚天冬氨酸可以提高細胞內氨基糖苷類藥物濃度并且降低毒性。在給予慶大霉素的同時給予聚天冬氨酸,細胞內慶大霉素濃度是單獨使用慶大霉素的1·2~1·3倍。
4結語
聚氨基酸生物相容性好、容易被機體吸收、體內降解為氨基酸對人體無毒副作用,最為突出的是具有很多藥物或活性物質能與之共價鍵結合的功能團,聚氨基酸的研究已相當深入和廣泛。目前合成聚氨基酸多是采用氨基酸與三光氣作用形成氨基酸環內酸酐,采用伯氨基引發開環形成新的伯氨基酸再引發其他氨基酸環內酸酐的開環,如此循環,形成聚合物,但要工業化合成均一、質量穩定的聚氨基酸尚待研究。2008年日本窒素公司和福井縣立大學宣布發現了均聚氨基酸合成酶[27],這一發現給生物合成聚氨基酸提供了基礎。聚氨基酸在給藥系統中的應用已成為藥劑學研究熱點,并且正在進行臨床試驗,相信很快能得到廣泛應用。
