上皮細胞轉化大腸發展范文
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目前,大腸癌已是歐洲排名第2位的腫瘤致死性疾病,占腫瘤致死性疾病的10%左右.引起大腸癌發生的原因眾多,如基因突變引起的家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP)、DNA錯配修復基因(MMR)突變引起的遺傳性非息肉性結腸癌(herediarynonpolyposiscol-orectalcancer,HNPCC)、Crohn''''s病、潰瘍性結炎、上皮細胞內癌基因激活和抑癌基因失活等均與大腸癌的發生發展密切相關[1].上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指在生理或病理情況下發生細胞上皮-間質轉變,同時伴隨細胞形態與相關基因表達的改變.EMT在胚胎形成以及組織器官發育過程中也起著重要作用(如中胚層和神經冠結構形成以及心臟形態發生過程[2]),但也可引起器官纖維化和參與腫瘤形成過程,在此過程中上皮細胞頂-底極性改變、橋粒等緊密連接結構消失、細胞骨架重組,波形蛋白表達上調、角蛋白表達下調,從而使細胞離體、獲得遷移能力,并能抵抗細胞凋亡[3].近來研究發現EMT在大腸癌發生發展過程中起著重要作用,并與腫瘤細胞的浸潤和轉移有著非常密切的關系.1EMT在炎癥促進大腸癌發生發展中的作用慢性炎癥被認為是包括大腸癌在內的許多種人類腫瘤疾病的原因之一,流行病學和臨床研究均證實兩種主要的炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD):潰瘍性結腸炎和Crohn''''s病[4]發展成大腸癌的風險明顯升高.慢性炎癥可以通過誘導細胞DNA修飾導致腸上皮細胞發育不良,此外還可通過DNA甲基化和組蛋白修飾等作用影響腸上皮發育過程[5].Bataille等[6]在Crohn''''s病瘺管形成過程中發現腸道上皮標志物E-cadherin和?-catenin表達降低(?-catenin在EMT的起始階段合成增加,而在EMT最終階段合成明顯減少[7]);間質標志物?-integrin表達增多(TGF-?激活EMT的過程依賴于?-integrin,然后通過Smad3依賴性的轉錄過程或者非Smad3依賴性、p38MAPK激活和GTP酶調節的信號傳導途徑[8]),而該蛋白隨著EMT的進展逐漸由胞膜向胞質、胞核轉移,?-catenin移位被認為是Crohn''''s病發展過程中EMT的關鍵分子步驟.
在腫瘤相關炎癥(cancerrelatedinflammation,CRI)相關分子中發現一些重要的始動因子,包括NF-?B、STAT3[9]、IL-1?、IL-6、IL-10和TNF-?等.NF-?B是一種關鍵的內源性炎癥/免疫調節因子[10].Douglas等在大腸癌細胞中發現了異常的NF-?B調節,且證實在結腸腫瘤起始和發展中NF-?B和CRI之間存在密切聯系,通過靶向滅活IkappaB使腫瘤浸潤白細胞中NF-?B失活抑制了炎癥相關大腸癌的發生,從而為結腸腫瘤中NF-?B和炎癥細胞的作用提供了基因水平證據.IL-6是NF-?B激活的一個主要效應分子,并且與STAT3存在密切關系,他具有促進生長和抗凋亡能力[11].研究發現IL-6能保護正常腸上皮細胞和癌前細胞免受凋亡,并促進腫瘤起始細胞增殖,在此過程中NF-?B-IL-6-STAT3通路起著重要作用.Lee等[12]發現大腸癌中NF-?B的活化狀態需要STAT3維持,提示STAT3是腫瘤細胞增殖和存活的關鍵因子,并調控了c-Myc、Mcl-1、CyclinD和Bcl-2表達[13].抑制因子從不同水平上調控NF-?B信號通路,Tir8是表達于腸黏膜上IL-1R家族的一員,他能夠通過阻止IRAK-1和TRAF-6,抑制信號從IL-1R/TLR復合物傳導[14].在小鼠大腸癌腫瘤模型中發現NF-?B下游分子CCL2、CCL3、IL-1和IL-6能夠促進炎癥相關的腫瘤形成,并發現NF-?B激活過程中Tir8的缺失直接導致了大腸癌形成[15].腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociatedmacrophages,TAM)分泌的TNF通過抑制GSK-3?促進了Wnt/?-catenin信號傳導,促進了結腸上皮細胞向間質轉化,此過程在大腸癌發展中起著重要作用[16].此外,炎癥細胞中NF-?B激活也造成了COX-2和ROS水平升高,ROS能誘導DNA損傷、DNA甲基化、轉錄后修飾和腫瘤抑制基因突變等[7];控制炎癥反應和誘導腫瘤細胞凋亡的TGF-?和低氧誘導因子-1(hypoxia-induciblefac-tor-1,HIF-1)同樣是炎癥微環境中促使上皮細胞發生間質轉化的潛在誘導因子[17].Grivennikov等[17]證實IL-6與其受體sIL-6?結合后停留在細胞表面并能借助胞內TGF-?通路促進結腸上皮向惡性轉化;IL-10激活STAT3(信號傳導蛋白-轉錄激活物)后通過與IL-6相似的途徑介導細胞惡性轉變[18].TGF-?作為炎癥因子可造成包括腸道在內的多器官自身免疫性疾病,且可激活多種信號通路如Erk、c-Jun、JNK、PI3K和RhoA等[19],也能誘導某些轉錄因子和轉錄調節因子在EMT中的表達,包括?EF1、SIP1和Snail等,從而有利于結腸上皮EMT的發生[20].TNF-?在IBD發病機制中是一種重要的炎癥因子,在炎癥相關大腸癌(colitisas-sociatedcolorectalcancer,CAC)中也起著重要作用[21],TNF-?在CAC中主要依賴激活胞內轉錄因子NF-?B進行信號傳導,通過NF-?B的多向性轉錄激活作用(NF-?B可以結合至靶基因MMP-9、IL-8、uPA、VEGF、CXCR4、骨橋蛋白等的啟動子或增強子之上進行調控[22])誘導結腸上皮細胞向腫瘤細胞分化、增殖,并抑制細胞凋亡、促進腫瘤侵襲和轉移[23].此外,其他炎癥因子如IL-12、IL-13和INF-?等在慢性大腸炎發展過程中也參與了腫瘤形成過程,而TGF-?、IL-10則能在此過程中發揮協同作用[24].目前已證實上述參與炎癥發生和發展的各種細胞因子如,TGF-?、TNF-?和NF-?B等均是EMT信號通路的關鍵因子,可見EMT參與了炎癥促進大腸癌發生和發展的相關過程,但是EMT在此過程中的詳盡機制尚待進一步研究.
2EMT在腺瘤性息肉病相關的大腸癌發生發展中的作用
FAP在結腸腺瘤性息肉疾病中占有主要地位,相關研究證實位于染色體5q21的APC突變失活是FAP的主要原因[25],APC突變被認為啟動了大腸癌發生的多步驟過程,最終FAP往往發展成為大腸癌[26].與FAP相同的是絕大多數散發大腸癌病例起源于結腸腺瘤且同時伴有APC突變.Vécsey-Semjén等[27]證實小鼠敲除APC外顯子exon14后可導致結腸腺瘤發生,免疫組織化學檢測該模型結腸上皮細胞中可見Wnt信號通路的關鍵因子?-catenin在胞質和胞核中積累,且編碼C-Myc和CyclinD1的mRNA也顯著增加.APC是一種腫瘤抑制基因,可以作為Wnt/?-catenin的負性調控因子,在正常結腸上皮細胞APC/?-catenin復合物被絲氨酸-蘇氨酸激酶(GSK3?)磷酸化,導致?-catenin降解,而在APC突變失活及Wnt信號轉導通路開啟時GSK3?的磷酸化作用被抑制[28],使其不能誘發?-catenin降解,從而造成胞質內的?-catenin持續累積,后者作用于靶基因C-Myc和CyclinD1等,最終導致Wnt通路介導的EMT發生,正常結腸黏膜上皮向間質轉化,最終結腸上皮細胞發生惡性轉化[29,30].Lochter等[31]利用COGA-8結腸上皮細胞培養發現CyclinD1與CDK4、CDK6結合,誘導生成CyclinA和CyclinE,再與CDK2結合從而使結腸上皮細胞從G1期進入S期.C-Myc啟動子區域有?-catenin結合位點,因此C-Myc表達可以被Wnt通路上調,C-Myc過表達使其結合至CyclinD2啟動子特定的DNA序列并促進CyclinD2的轉錄過程[32].Wnt通路還能直接上調CyclinD1,因為CyclinD1啟動子區域包含LEF-1結合位點,而該位點被認為是Wnt通路的直接作用靶點[33].?-catenin在胞核內與淋巴細胞增強子結合因子1(LEF-1)和T細胞因子-4(Tcf-4)結合并作為轉錄共激活子啟動下游基因(Slug、Cdx-1、Id2和ENC1等)表達.APC上?-catenin結合位點的減少程度與Wnt通路中?-catenin/LEF-1/Tcf-4復合物增加的程度呈負相關[34],而?-catenin/LEF-1/Tcf-4的增加導致了結腸上皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1減少、胞間橋粒等連接蛋白降解、細胞骨架重組、細胞離體和獲得遷移能力[35],還可以直接作用于AP-1轉錄因子復合物中c-jun和fra-1的啟動子部位使該轉錄復合物增多、上調uPAR轉錄[36].此外,該復合物還能上調ZEB1表達(高表達于FAP腺瘤、結腸腺癌上皮細胞,且與胞核?-catenin水平呈正相關[37]),而ZEB1能抑制E-cadherin生成[38],且該轉錄激活復合物參與了腺瘤轉變為腺癌甚至腫瘤轉移的全過程[39].以上過程最終使結腸上皮細胞經歷EMT過程(如細胞間連接蛋白降解、細胞遷移能力增強和獲得間質表型等)并向惡性轉化.另外,CK2?是一種高度保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,可以磷酸化多種底物并在多種生理病理過程中起重要作用[40].正常結腸上皮細胞逐漸演變成腺瘤或腺癌的過程被認為與EMT及E-cadherin、Vimentin和?-catenin等基因表達改變緊密相關.Zou等[40]發現CK2?表達于正常結直腸上皮細胞和結直腸腺瘤/腺癌細胞,通過調節參與細胞周期的癌基因c-myc和抑癌基因p53和p21等影響了大腸癌的演變過程.CK2?敲除或轉染CK2?SiRNA后上皮標志物E-cadherin表達顯著升高、間質標志物vimentin表達降低,還能造成細胞中轉錄因子Snail1、Smad2/3和癌基因c-myc的表達下降,以上結果說明CK2?能夠對上皮間質轉變起到某種程度的抑制作用,但是CK2?影響結腸腺瘤向大腸癌轉變的具體機制尚未完全明確.
3microRNAs介導的EMT在大腸癌發生發展中的作用
microRNAs是一類長度在18-25nt的單鏈寡核糖核苷酸的非編碼RNA,具有高度的保守性、組織特異性和發育時序性[41],在轉錄后水平通過負向調節mRNA發揮其功能,與mRNA的靶向識別以與3''''末端UTR互補性結合為基礎[42].mi-croRNAs翻譯水平的抑制作用常伴隨由poly(A)尾加速脫腺苷化和后續核酸外切消化導致的靶mRNA水平減少[43],而且microRNAs控制其靶點特異性的關鍵區域在5''''末端2-7個堿基對的種子序列[44],可以在細胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝及胚胎發育等過程中起調控作用[45],部分microRNAs通過調控癌基因和腫瘤抑制基因的表達;部分通過直接作為癌基因或腫瘤抑制基因參與了大腸癌的病理過程[46].雖然microRNAs參與大腸癌發生發展的相關研究較多,但有關microRNAs在大腸癌中介導EMT的研究仍較少.研究證實在許多原發腫瘤及相應轉移瘤中存在不同程度的microRNA表達,在蛋白絡氨酸磷酸酶(PTP)Pez誘導MDCK的細胞系中發現了TGF-?參與EMT的過程,因為在該細胞系中發現了細胞間連接缺失和間質表型過表達.此外通過RT-PCR還發現miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和249)及miR-205表達的下調,而穩定的miR-200s過表達可以阻止TGF-?誘導的EMT,提示miR-200s是EMT的關鍵調控因子,且miR-200s是通過抑制ZEB1和SIP1的翻譯來調控EMT的[47].關于miR-200家族、ZEB1和SIP1,我們推測上皮細胞和間質細胞表型之間的轉化是由ZEB1和SIP1的水平決定的.ZEB1和SIP1結合至目的基因如上皮細胞關鍵基因E-cadherin啟動子成對的ZEB樣E-Boxs(CACCTG)上從而抑制這些基因的轉錄[48].以上證據提示miR-200s的丟失可能導致腫瘤的侵襲性增強,甚至造成遠處轉移.TGF?、TNF?由浸潤的炎癥細胞或腫瘤細胞產生,已被證實能夠誘導結腸癌細胞發生EMT,在結腸癌SW480細胞系中通過miRNA表達分析發現穩定敲除ZEB1能夠導致胞間連接蛋白E-cadherin表達上調、細胞遷移和侵襲的能力下降,而miR-141、miR-200b和miR-200c的表達水平明顯升高,且miR-141、miR-200c的表達上調最為明顯.此結果也被RT-PCR檢測所證實,提示這兩種miRNA參與了結腸癌EMT過程[49].而Colwell[50]利用TGF?/TNF?誘導LIM1863大腸癌細胞發生EMT的過程中發現miR-21和miR-31表達水平明顯升高;蛋白定量分析發現miR-21和miR-31促進了TGF?誘導的EMT的過程,與miR-200抑制EMT上游調控因子ZEB1/2不同,miR-21和miR-31主要作用于EMT下游因子T淋巴瘤侵襲轉移蛋白1(TIAM1),后者是一種RacGTPase交換因子[51].此外,miR-9和miR-335通過直接抑制E-cadherin和SOX4合成促進了大腸癌細胞轉移.以上結果說明某些microRNA可以在TGF-?信號通路的下游發揮作用從而促進結直腸癌的發生和轉移.啟動子超甲基化和腫瘤抑制基因沉默是腫瘤形成的重要分子標志.Davalos等[52]通過大腸癌原發腫瘤微切除證實5''''-CpG島超甲基化相關的miR-200b/200a/429和miR-200c/141多順反子轉錄沉默是調節EMT和MET轉變的重要步驟,也是大腸癌腫瘤進展的關鍵,并發現miR-200超甲基化和ZEB1/ZEB2上調與CDH1、CRB3和LGL2表達下調相關;TGF?誘導的EMT中miR-200超甲基化失活伴隨著E-cadherin丟失和Vimentin增加[53];Twist基因啟動子獲得CpG島超甲基化后即可誘導結腸上皮細胞發生間質轉化.此外,其他組蛋白修飾基因,如LSD1、CREB結合蛋白、SIRT1等也參與了EMT過程.deKrijger等[46]發現36%的大腸癌原發腫瘤中miR-34a表達下降,部分歸因于TP53的突變,部分是由于啟動子甲基化;EMT激活因子TGF?上調也促進了miR-21和miR-31表達,后兩者在大腸癌中促進了TGF?誘導的EMT過程.此外,miR-373、miR-126和miR-196a轉染的大腸癌細胞則顯示出明顯肺轉移潛能.Sreekumar等[54]證實E-cadherin表達受miR-9直接調控而轉錄抑制,miR-199和miR-218則是間質特征性蛋白N-cadherin的潛在直接調控mi-croRNA.miR-138、miR-488和miR-151能夠在EMT過程中調節FAK的表達水平從而影響大腸癌腫瘤細胞的遷移能力.
4大腸癌中EMT的有關信號通路在EMT介導大腸癌發生發展過程中伴隨著眾多信號通路的激活,將胞外信號傳導入胞內引起E-cadherin、Vimentin等異常、表型改變、基底膜降解、上皮細胞向間質轉變和細胞遷移等一系列變化,最終導致正常結腸上皮細胞轉變為大腸癌細胞.
4.1Wnt/?-catenin和FGF信號傳導通路Wnt信號需要通過標準和非標準的信號通路傳導,FGF信號通過PI3K-AKT、MAPK和PLC?通路傳導.GSK3?是Wnt標準信號傳導通路和FGF依賴性PI3K-AKT信號傳導通路的關鍵分子.標準的Wnt信號通路決定細胞的分化方向,非標準的信號通路控制細胞的極性和運動潛能,前者通過卷曲家族受體(Frizzled)和LRP5/LRP6受體進行信號轉導,后者通過Frizzled和ROR1/2共同受體進行信號傳導.LRP5和LRP6是LDL家族的蛋白分子,胞外有Wnt結合位點,胞內有Axin模體結構.除Wnt信號外,?-catenin為實現在蛋白化及蛋白酶體介導的降解而與GSK3?結合并被后者磷酸化[55],標準的Wnt信號誘導Friz-zled-Dishevelled復合物與LRP5/LRP6-AXIN-FRAT結合,使?-catenin從GSK3?釋放,最終在胞核中穩定的累積.?-catenin與TCF/LEF、BCL9/9L結合成TCF/LEF-?-catenin-Legless-PYGO復合物,作為Wnt信號通路的效應物[56].非標準Wnt信號通路中ROR1和ROR2是受體型絡氨酸激酶,胞外為Wnt結合位點,胞內為CKI?結合結構域,RhoA、c-JUN、N末端激酶(JNK)、Nemo樣激酶(NLK)是非標準Wnt信號通路的效應物.FGF與受體結合后誘導受體二聚化、絡氨酸激酶活化及受體自身磷酸化,FRS2、FRS3和PLC?與磷酸絡氨酸殘基相互作用被募集至FGF受體,然后FRS2/3招募GRB2、SHP2,FRS2/SHP2/GRB2復合物募集GAB1激活PI3K,導致GSK3?活性下降、Snail-EMT級聯反應激活、E-cadherin/?-catenin表達下調、結腸上皮細胞惡性轉化,最終參與了大腸癌的發生發展過程[57].基因分析發現Dishevelled是Wnt通路的正向調控蛋白,它發揮作用時處于受體下游、?-catenin的上游,能導致c-Myc和cyclinD基因在結腸癌細胞中出現擴增[58].
4.2Ras信號傳導通路Ras蛋白在調節大腸癌發生發展的信號通路中起著重要作用.生長因子活化的受體激活后,活化的Ras通過Raf激酶激活MAPK激酶(MEK1、MEK2),導致胞外ERK1、ERK2激活[59].ERKs位移至細胞核并激活核轉錄因子,如Elk-1、ATF-2、ETS1/2,使癌基因轉錄迅速開啟.首先,BRAF是Raf家族的一員,他的突變與增強了的激酶活性有關,且在9%-11%的結直腸癌中發現此現象;其次,在30%-40%的腺瘤和76%的結直腸癌腫瘤中證實MEK磷酸化及激活;再次,結直腸癌中呈現ERK的高度激活,且證實ERK1、ERK2活性在腸道腫瘤中明顯升高;最后,試驗證實阻斷MEK/ERK抑制了結腸癌細胞的生長,表明ERK參與了結腸癌細胞的增殖.MEK1通過Egr-1、Fra-1增強Snail1/2表達而下調E-cadherin[60].另有研究證實結腸上皮細胞表達活化的MEK1獲得了向腫瘤細胞轉變及轉移的潛質.除MAPK途徑外,Ras還可通過PI3K和RhoGTPase或與TGF-?協同誘導大腸癌EMT.PI3K激活后影響EMT過程的機制如前所述;此外,PI3K/Akt能夠使RhoGTPase激活,也能與TGF?通路相互作用從而影響大腸癌EMT過程[61].
4.3PI3K信號傳導通路磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)通路對正常細胞代謝、生長及腫瘤進展起著重要作用.PI3K的抑制因子PTEN缺失(10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源敲除)與結腸腫瘤相關,證實PI3K信號通路在大腸癌發生過程中起著重要作用.近年來研究提示66%-70%的大腸癌中PTEN表達下調,且與微衛星不穩定緊密相關.此外還證實TNF?造成了PTEN下調.IEC-6和HIE細胞敲除PTEN后?-catenin表達水平明顯升高,大腸癌SW480細胞中V-catenin表達也有輕度升高,提示?-catenin的表達受PTEN調控.利用LY294002或Wortmannin抑制PI3K降低了c-Myc和cyclinD1表達,而在RIE-1細胞中敲除PTEN則顯著上調了上述蛋白的表達;同樣在IEC-6和HIE細胞中使PTEN沉默增加了c-Myc和cyclinD1的表達,說明PTEN丟失可以通過促進細胞增殖、抑制凋亡而影響大腸癌的發生[62].Bowen等[63]發現在野生型PTEN結腸腫瘤細胞中Akt2過表達導致了腫瘤微轉移的形成,提示Akt可能是作為TGF-?1下游調控因子發揮作用的.PI3K/Akt通路下游的效應分子mTOR激酶調控著CRC腫瘤的發生,且證實mTORC1和mTORC2通過RhoA和Rac1通路調控著結腸癌細胞的遷移能力.
4.4Notch和Hedgehog信號傳導通路Notch通路在胚胎發育和內環境穩定中發揮著重要作用,其異常激活參與了多種腫瘤的發展過程.該通路激活是由Notch配體(Jag1、Jag2、DLL1、DLL3和DLL4)結合至相應受體上引起的.配體在細胞外被蛋白酶裂解、在胞內被?-分泌酶裂解[64],使得Notch胞內結構域(NICD)轉至細胞核,在胞核中與CSL和其他共刺激因子如Maml1、2、3構成轉錄激活復合物,最終激活Notch通路的靶基因Hes和Hey1,使上皮細胞惡性轉化.研究顯示大腸癌EMT的誘導因子ZEB1可通過抑制miR-200表達而穩定Notch通路的Jag1、Maml2和Maml3,并證實ZEB1通過提高Jag1的表達而增強Notch通路激活通路存在交互作用[66].雖有研究[67]證實Hedgehog通路能誘導Snaill表達上調,但是尚未證實Hedgehog對Snaill有直接轉錄激活作用.另外Hedgehog能誘導JAG2表達上調、促進TGF?分泌[68],TGF-?1激活使胞核內NF-?B調控的ZEB1和ZEB2表達上調,同樣使Smad-Sp1調控的間質標志物Vimentin等表達上調從而促進大腸癌細胞遷移及侵襲.
5結論
在胚胎發育中EMT是必需的生理過程,而腫瘤組織誘導產生的EMT則是腫瘤浸潤和轉移的重要機制之一.目前,越來越多的證據表明EMT在與腫瘤發生、發展機制中起著重要的作用,隨著對EMT作用機制的研究不斷深入以及對其信號通路和關鍵分子的逐步了解,相關的研究結果為臨床治療腫瘤提供了重要的靶點與途徑.由于EMT主要是由E-cadherin的轉錄抑制因子誘發的,因此借助靶向抑制Snail等的治療方法為防止腫瘤進展提供了可能.此外,EMT信號傳導通路中的關鍵分子GSK-3?、PAK和TGF?等將來也有可能成為阻斷EMT的重要靶點.雖然目前對EMT發生機制的研究尚未完全清楚,但是隨著相關研究的不斷深入,人們對EMT的了解將會變得更加清晰.