促雙歧桿菌分析與討論范文

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一、海藻多糖促雙歧桿菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1．樣品

羊棲菜多糖：利用乙醇沉淀法從羊棲菜中提取。

海帶多糖：利用乙醇沉淀法從海帶中提取。

海藻為馬尾藻科植物海蒿子或羊棲菜的藻體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅(jiān)，利水消腫之作用。《本草綱目》中記載：海藻，現(xiàn)咸能潤(rùn)下，寒能泄熱引水，故能消癭瘤，結(jié)核之堅(jiān)聚，而除浮腫、腳氣、痰氣之濕熱，使邪氣自小便出也。

昆布為海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的葉狀體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅(jiān)，利水消腫之作用。《別錄》記載昆布，主十二種水腫，癭瘤聚結(jié)氣。

本實(shí)驗(yàn)中將用羊棲菜和海帶

羊棲菜[Sargassumfusiforme(Harv.)Setch]：藻體黃褐色，肥厚多汁，高15~40cm。固著器為是北太平洋西部特有的暖溫帶植物，屬褐藻類馬尾藻科。是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的藻類，干品每百克含蛋白質(zhì)10.6克，糖類47克，灰分18.3克，脂肪1.3克，鈣1400毫克，磷100毫克，鉀4400毫克，鐵5.5毫克，胡蘿卜素550毫克；還有多種維生素和微量元素。

海帶[LaminariajaponicaAresch]屬褐藻門海帶科，是一種大型食用海藻，有豐富的營(yíng)養(yǎng)。每100克海帶中含有蛋白質(zhì)8克，甘露醇14克，鉀4.36克、鐵150毫克，超過(guò)菠菜，油菜幾倍至幾十倍。更為突出的是，海帶富含微量元素碘，每100克海帶含碘高達(dá)24000微克。

多糖提取工藝

取海藻置于托盤放入恒溫培養(yǎng)箱低溫烘干，用電磨機(jī)打碎，使之成粉末狀。用天平稱取海藻粉50g放入500ml錐形瓶中加蒸餾水250ml放置于95℃水浴鍋中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷卻到室溫。離心取上清液，在離心管中加無(wú)水乙醇，得到沉淀再次離心，取沉淀(多糖)，用蒸餾水沖洗數(shù)遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀為粗多糖。

2．培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基：

蛋白胨10g、肉浸膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、K2HPO42g、醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·4H2O0.05g、蒸餾水1000ml。pH值6.4。

20％肉湯：蛋白胨1g、肉浸膏1g、蒸餾水1000ml。pH值6.4。

3．菌株：取自麗珠腸樂膠囊（由雙歧桿菌制成的干粉膠囊），珠海麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)20030404。

4．實(shí)驗(yàn)儀器

（二）實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

1．菌液與溶液制備

菌液制備：無(wú)菌條件下，從麗珠腸樂膠囊中取出內(nèi)容物，溶解于10ml濃度為0.9％的無(wú)菌生理鹽水，攪拌均勻后用接種針蘸取少許溶液，涂布于無(wú)菌MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃下，于厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)3d。再?gòu)钠桨逯刑羧∩珴傻S、圓滑突起的單菌落，接入40mlMRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)2d。取少量培養(yǎng)液，測(cè)得菌液濃度為2.7×108個(gè)/ml。使用前稀釋至1.0×108個(gè)/ml備用。

多糖溶液制備：利用蒽酮硫酸法測(cè)得醇沉淀中多糖含量：羊棲菜：25.2％；海帶：24.7％；將2種粗多糖分別配制成一定濃度的溶液，并按實(shí)驗(yàn)需要稀釋為8.0％、4.0％、2.0％、1.0％、0.5％的水溶液，每管各10ml，分別加入濃度為20％的肉湯培養(yǎng)基10ml混勻，同時(shí)制備作為對(duì)照的10％肉湯，115℃濕熱滅菌15min后備用。

原理：糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，于620nm處有最大吸收，顯色與多糖含量呈線性關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取0.1g/L的葡聚糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80ml，用蒸餾水補(bǔ)到1.00ml；分別加入4.00ml蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完一起進(jìn)入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸10分鐘取出，用自來(lái)水冷卻，室溫放置10分鐘左右，于620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進(jìn)行比色。以光密度(OD值)為縱坐標(biāo)，糖的含量微克數(shù)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品含量測(cè)定：取相當(dāng)于糖濃度50μg/ml左右的樣品溶液1.00ml，加入蒽酮試劑，同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作之操作，比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算含量。

標(biāo)用分析天平取海帶多糖0.1213g，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進(jìn)行吸光度測(cè)定。得吸光度：0.153，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖29.9ug海帶提取物含多糖％＝0.0299×1000/121.3×100%=24.7%

用分析天平取羊棲菜多糖0.2008g，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進(jìn)行吸光度測(cè)定。得吸光度：0.254，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖50.6ug

羊棲菜提取物含多糖％＝0.0506×1000/200.8×100%=25.2％

二．促雙歧桿菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

（一）時(shí)間因素

取3組濃度為2.0％、1.0％的多糖溶液管與作為對(duì)照的10％的肉湯液體管各10ml,加入濃度為107個(gè)/ml的雙歧桿菌菌液各0.1ml，37℃厭氧培養(yǎng)。12h、24h、48h后，分別取樣用無(wú)菌生理鹽水稀釋，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計(jì)算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。結(jié)果見表1。以雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)。

（二）濃度因素

根據(jù)表1選擇最佳的多糖溶液培養(yǎng)時(shí)間24h。取兩組海藻多糖濃度為4.0％、2.0％、1.0％、0.5％、的多糖肉湯溶液管以及作為對(duì)照的10％肉湯管各9ml，分別加入濃度為106個(gè)/ml的雙歧桿菌菌液1ml，37℃厭氧培養(yǎng)24h，取樣用無(wú)菌生理鹽水稀釋后，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計(jì)算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。表2即為各濃度多糖培養(yǎng)液中雙歧桿菌的活菌數(shù)。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果換算成以10為底的對(duì)數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果見表3。以雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，多糖濃度為橫坐標(biāo)，繪得圖2。

三、分析與討論

從表2可以看到，在試驗(yàn)濃度下，各類海藻多糖對(duì)雙歧桿菌均有顯著的促生長(zhǎng)作用。加入不同濃度多糖的各試管雙歧桿菌活菌數(shù)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。圖2顯示，多糖在0.5％～2.0％的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，增長(zhǎng)較為平緩，當(dāng)濃度為2.0％的時(shí)候到達(dá)頂峰。說(shuō)明在這一范圍內(nèi)，羊棲菜多糖對(duì)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用與濃度呈正相關(guān)。然而在多糖濃度為4.0％的時(shí)候，雙歧桿菌活菌數(shù)出現(xiàn)下降。推測(cè)其原因，隨著多糖濃度的增高，培養(yǎng)液滲透壓也逐漸增大，使環(huán)境變得不利于雙歧桿菌生長(zhǎng)，從而造成菌數(shù)減少。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示適合雙歧桿菌生長(zhǎng)的羊棲菜多糖濃度在2.0％～4.0％之間。在不同的海藻多糖之間，雙歧桿菌的活菌數(shù)也存在著差異，海帶多糖的促生長(zhǎng)作用較強(qiáng)，而羊棲菜促生長(zhǎng)則相對(duì)較弱，與前者相差一倍。在2.0％多糖濃度下37℃培養(yǎng)24h，各類海藻多糖的促生長(zhǎng)作用最強(qiáng)，海帶多糖培養(yǎng)液可以使雙歧桿菌的活菌數(shù)達(dá)到原來(lái)的6倍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海藻多糖是非常優(yōu)良的雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子，能有效增加腸道內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量。在服用海藻多糖時(shí)應(yīng)控制好多糖的用量或者采用緩釋技術(shù)，使得多糖在一個(gè)合適的濃度到達(dá)腸道，并保持一定的時(shí)間，對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，促進(jìn)雙歧桿菌在腸道內(nèi)的增殖和定植，優(yōu)化腸道的結(jié)構(gòu)，維護(hù)機(jī)體的生態(tài)平衡，達(dá)到最佳的保健功效。根據(jù)表1，雙歧桿菌在厭氧條件下37℃培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達(dá)到高峰，此時(shí)是獲得雙歧桿菌最高生物量的最佳時(shí)間，為雙歧桿菌為主的微生態(tài)活菌制劑生產(chǎn)提供了有用的條件參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)采用了10％肉湯培養(yǎng)基為基質(zhì)，使各種營(yíng)養(yǎng)成分降低到僅能維持備試菌生長(zhǎng)的濃度，目的是減少營(yíng)養(yǎng)成分的影響，更能準(zhǔn)確反應(yīng)添加各類多糖的促進(jìn)效果。目前增殖腸道內(nèi)雙歧桿菌有兩種方法，一是通過(guò)攝取含雙歧桿菌的食物，補(bǔ)充雙歧桿菌的不足。二是服用促雙歧桿菌生長(zhǎng)的雙歧因子，直接扶持、促進(jìn)腸道中原雙歧桿菌的生長(zhǎng)、繁殖，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，起調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。但前者由于在儲(chǔ)存過(guò)程中活菌數(shù)不穩(wěn)定而影響了治療效果。本研究證實(shí)，海藻多糖是一種新的天然雙歧因子，它對(duì)雙歧桿菌促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)為海藻類中藥的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也提示我們正確利用野生植物資源。如把海藻這類資源豐富的野生植物改造成營(yíng)養(yǎng)保健食品，前景是非常廣闊的。