HPLC法檢測血清中伏立康唑含量范文

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【摘要】目的建立人體血清樣本中伏立康唑含量檢測方法。方法色譜柱為依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流動相為水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；檢測波長:258nm。結果伏立康唑在0.14～13.96μg/ml濃度范圍內呈良好的線性關系，r=0.998。結論實驗建立的hplc方法可以用于血清樣本中的伏立康唑含量檢測。

【關鍵詞】伏立康唑血清樣本HPLC含量測定

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodtodeterminatethevoriconazolecontentinhumanserumsamples.MethodsEliterC18column（200mm×4.6mm,5μm）wasusedwiththemobilephaseofwater-acetonitrile-aceticacid-triethylamine（64:36:0.1:0.05）.Theflowratewas1.2ml.min-1andthewave-lengthwas258nm.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.14-13.96μg/ml（r=0.998）.ConclusionTheestablishedHPLCmethodcanbeusedinthedeterminationofvoriconazolecontentinhumanserum.

【Keywords】voriconazole;serumsample;HPLC;determination

伏立康唑（voriconazole,VRC）是一個三唑類抗真菌藥物，其作用機制是抑制真菌細胞色素p450依賴的14α-固醇脫甲基酶，而本品對于真菌細胞色素p450酶比對各種哺乳動物的細胞色素p450酶系統更具選擇性。伏立康唑在0.03～64μg/ml的濃度范圍內對幾乎所有的實驗真菌，包括致病性酵母菌和絲狀菌屬及雙芽生菌的分離菌株均有作用。對一些條件致病真菌如曲霉菌屬、隱球菌屬及念珠菌屬包括對氟康唑耐藥的克柔念珠菌均有抗菌活性。本實驗旨在建立血清樣本中伏立康唑濃度檢測方法。

1實驗材料

伏立康唑對照品，中檢所提供。卡馬西平對照品，中檢所提供。乙腈：色譜純，天津市科密歐化學試劑開發中心，批號：20051120。冰醋酸：分析純，天津市化學試劑三廠，批號：20061228。三乙胺：分析純，天津市東麗區天大化學試劑廠，批號：20040806。

Waters515高效液相泵，717自動進樣器，996紫外檢測器，Empower色譜工作站。

2色譜條件及血漿樣本處理方法［1～4］

2.1色譜條件色譜柱為依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流動相為水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；檢測波長：258nm；柱溫：室溫。

2.2標準液制備精密稱取伏立康唑對照品0.0340g，加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀釋至刻度,即得698μg/ml的伏立康唑對照品溶液。精密稱取卡馬西平對照品0.0050g，用流動相溶于100ml容量瓶中并稀釋至刻度，即得50μg/ml的內標溶液。

2.3血漿樣品的處理取血漿0.2ml，內標10μl（卡馬西平50μg/ml），混勻，再加入0.5ml甲醇，旋渦振蕩0.5min，16000r/min離心5min;吸取上清液100μl進樣。3方法學研究

3.1專屬性在選定的色譜條件下，伏立康唑與內標卡馬西平完全分離，且峰形良好，兩者保留時間分別約為8.4min和5.4min，空白血漿、空白血漿加藥物及內標、含藥血漿加內標按4法處理后，色譜圖見圖1。Ⅰ:空白血漿；Ⅱ:空白血漿加藥；Ⅲ:含內標血漿；IV：2號受試者用藥后2h色譜圖

A：卡馬西平,B：伏立康唑

圖1伏立康唑色譜圖3.2標準曲線及線性回歸方程用伏立康唑對照品溶液（698μg/ml）配制標準曲線工作液：將698μg/ml對照品溶液依次用流動相稀釋，得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20μg/ml。

取空白血漿0.19ml分別置于系列試管中，分別加上述標準曲線溶液各10μl，配制成血漿濃度為樣，按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96μg/ml的血漿標述4方法處理血漿樣品，測定樣品及內標的峰面積，計算其峰面積比值（伏立康唑/卡馬西平，A），以峰面積比值A對血漿濃度C進行線性回歸分析，求得線性回歸方程為：C=5.117A+0.024（w=1/cc），r=0.998。結果表明，伏立康唑血漿濃度在0.14～13.96μg/ml濃度范圍內，線性關系良好，血漿樣品可進行定量檢測的最低濃度為0.14μg/ml。見圖2。

圖2伏立康唑血漿標準曲線

3.3絕對回收率各取空白血漿0.19ml于15個空白試管中，5個為一組，分別加入8.37μg/ml（低濃度）、55.84μg/ml（中濃度）、139.60μg/ml（高濃度）伏立康唑對照品溶液10μl。得濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿樣品。按上述4方法處理血漿樣品，進樣100μl，記錄色譜峰面積。

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bsp;另外，用純水代替血漿重復以上步驟，記錄色譜峰面積。以此為標準，將兩組峰面積進行比較，計算伏立康唑的絕對回收率，結果見表1。

3.4相對回收率試驗各取空白血漿0.19ml于15個空白試管中，5個為一組，分別加入8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑對照品溶液10μl，得濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿樣品。按上述4方法處理血漿樣品，進樣100μl，記錄色譜峰面積的比值。將比值代入標準曲線，與理論值進行比較，計算伏立康唑的相對回收率，結果見表1。

3.5精密度試驗取空白血漿0.19ml置于離心管中，分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑對照品溶液各10μl，按上述4血漿樣品處理方法處理后，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標樣各15份，按上述4方法處理血漿樣品，于同日和連續2日內各進樣100μl，測定樣品和內標的峰面積，計算其峰面積比值（A），并按回歸方程求出對應濃度，以此計算其日內和日間變異，結果見表2。表1回收率試驗表2精密度試驗

3.6穩定性試驗取空白血漿0.19ml置于離心管中，分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑對照品溶液各10μl，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標樣各20份，分別于配制后立即、室溫放置4h后，24h后反復凍融三次和1個月后，按上述4血漿樣品處理方法處理，測定樣品和內標的峰面積，計算其峰面積比值（A），并按回歸方程求出對應濃度并比較測定濃度，以考察樣品穩定性。結果見表3。

4結果

測定血清樣品中均勻加入低、中、高對照樣品，以評價測定結果的準確性。配制方法：取空白血漿0.19ml置于離心管中分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑對照品溶液各10μl，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標樣，按上述4血漿樣品處理方法處理后，進樣100μl，結果見表4。

5結論

本實驗建立起的HPLC檢測伏立康唑血清樣本含量的方法可行，檢測的數據真實可靠，可以作為血清樣本中伏立康唑含量測定方法。表3樣品穩定性試驗表4血清樣品中伏立康唑檢測結果

【參考文獻】

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