生物素與氨基酸對林可霉素生物合成范文

本站小編為你精心準備了生物素與氨基酸對林可霉素生物合成參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

【摘要】在合成培養基中利用林可鏈霉菌發酵生產林可霉素。當向培養基中加入生物素和氨基酸時，林可霉素的產量受到很大影響。本研究中首先采用兩水平因子設計法篩選出6個顯著影響因子，即生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸；然后采用中心組合設計法，得到上述6因子的優化含量分別為30μg/L、100.5、83、29、117.5和58.5mg/L；最后在搖瓶中進行驗證實驗，優化條件下發酵液的生物效價為2116μg/ml；對照樣品I(培養基中無生物素和氨基酸)和II(培養基中按原配方加入6個顯著影響因子)的生物效價分別為893和1481μg/ml，與樣品I和II比較，生物效價分別提高136.62%和42.88%。

【關鍵詞】林可鏈霉菌；林可霉素；發酵；生物合成；響應面法

Effectsofbiotinandaminoacidsonbiosynthesisoflincomycin

LiXiao1,ChuJu1,ZhangSiliang1,HangHaifeng1,

ZhuangYingping1andGeYouqun2

(1StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237;

2JiangxiGuoyaoPharmaceuticalCo.,Ltd,Nanchang330052)

ABSTRACTStreptomyceslincolnensiswasutilizedtoproducelincomycinbyfermentationinchemicallydefinedmedium,enormouseffectontheyieldoflincomycinwouldoccurwhenbiotinandaminoacidswereaddedtothemedium.Inthisresearch,firstly,6significantfactorswerefoundwithtwolevelfactorialdesign,namelyDbiotin,Lglutamicacid,Lvaline,Lmethionine,LleucineandLtyrosine;secondly,theoptimizedingredientsof6factorsmentionalabovewereobtainedwithcentralcompositedesign,theywere30μg/Land100.5,83,29,117.5and58.5mg/Lrespectively;finally,verificationtestwasaccomplishedinshakingflasks,thetitreofthefermentedbrothwas2116μg/mlontheoptimizedconditions,butthetitresofthecontrolI(withoutDbiotinandaminoacidsinthemedium)andcontrolII(adding6significantfactorstomediumaccordingtooriginalingredients)were893μg/mland1481μg/mlrespectively,compairedwithcontrolIorII,increasedby136.62%and42.88%.

KEYWORDSStreptomyceslincolnensis;Lincomycin;Fermentation;Biosynthesis;Responsesurfacemethod

林可霉素是一種高效廣譜抗生素，臨床用于由抗革蘭陽性菌引起疾病的治療［1］。林可霉素A的分子式為C18H34N2O6S，分子量為406.56，它與林可霉素B在結構上的區別［2，3］為：林可霉素A4位上為正丙基，而林可霉素B4位上是乙基，兩者在藥理上存在著很大的區別，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但對人的毒副作用較大。我國藥典要求成品中B含量小于5%。

林可霉素屬于林可胺類抗生素，由L酪氨酸和磷酸戊糖循環(戊糖5磷酸和景天糖7磷酸)的中間產物縮合而成，整個生物合成途徑包括兩個分支［4］：一個由L酪氨酸合成丙脯氨酸(PPL)，另一個由景天糖7磷酸構成α甲硫林可胺(αMTL)。林可霉素A的推測生物合成途徑已有文獻報道［5］，并提出酪氨酸是上述第一個分支途徑的主要前體。

關于提高林可霉素產量的方法比較多，可在發酵液中加入前體［6］，也可用磷酸鹽對發酵過程進行調節［7～10］。在實際的大生產中，常常采用少量多次補入玉米漿來實現發酵過程的調節。玉米漿的主要成分為每100g干物質中含生物素1mg、蛋白質43g和結合氨基酸22.8g等，隨著玉米漿的補入，細菌中輔酶Q的合成量提高，細胞的呼吸強度也增加［11］。

D型生物素是許多微生物必不可少的生長因子。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3甲基巴豆酰CoA羧化酶4種羧化酶的輔酶成分［12］，它對糖代謝、脂肪酸代謝及蛋白質和氨基酸代謝有較大的影響。L型氨基酸對微生物的生長和代謝具有很重要的作用，它們一方面可經過脫氨或轉氨基反應生成對微生物的生長有刺激作用的物質，如分支脂肪酸，另一方面經過脫羧等多步反應生成丙酮酸、草酰乙酸、丙酰CoA及琥珀酰CoA等，對三羧酸循環有一定的強化作用［13，14］。

本文采用合成培養基進行搖瓶發酵實驗，選擇玉米漿中含量較豐富的D生物素、L谷

氨酸、L纈氨酸等15個因子首先進行兩水平因子設計實驗，以篩選出顯著影響因子，然后進行響應面設計實驗，通過軟件分析得到優化的發酵培養基配方。

1材料與方法

1.1菌種

林可鏈霉菌(Streptomyceslincolnensis)L427，由江西國藥有限公司提供。

1.2培養基

種子培養基(%)淀粉1.9，葡萄糖2.5，黃豆餅粉2.3，玉米漿2.6，硫酸銨0.2，硝酸銨0.14，氯化鈉0.07，硝酸鈉0.086，磷酸二氫鉀0.005，碳酸鈣0.68。

玉米漿購自華北制藥康欣有限公司，批號20060701。

發酵培養基(%)葡萄糖3.0，硫酸銨0.1，硝酸銨0.2，氯化鈉0.05，磷酸氫二鉀0.25，檸檬酸鈉0.3，硫酸鋅0.0001，硫酸亞鐵0.0001，硫酸鎂0.15，碳酸鈣0.8。

實驗設計所用D生物素和L型氨基酸購自Sigma公司。

1.3培養條件與培養方法

種子培養種子搖瓶于30℃，220r/min培養48h。

搖瓶發酵培養按30%的接種量將種子液接入發酵培養基，30℃，220r/min，培養168h。

1.4生物效價的測定

采用管碟法［15］。鑒定菌為藤黃八疊球菌［Sarcinalutea，CMCC(B)28001］，由江西國藥有限責任公司提供。林可霉素(lincomycin)標準品購自Sigma公司。

2結果與討論

2.1實驗設計

本文中發酵培養基采用化學合成培養基，通過兩水平因子設計(2LevelFactorialDesign)實驗可迅速找出生物素和氨基酸中對林可霉素的發酵生產有顯著影響的因子，進一步對顯著影響因子進行響應面設計(responsesurfacedesign，RSD)實驗，對結果進行優化分析可得到優化配方。所采用的實驗設計、數據分析軟件為DesignExpert7.0［16］。

在大量實驗基礎上，選用D生物素(A)、L谷氨酸(B)、L蘇氨酸(C)、L絲氨酸(D)、L纈氨酸(E)、L脯氨酸(F)、L甘氨酸(G)、L蛋氨酸(H)、L天冬氨酸(J)、L精氨酸(K)、L丙氨酸(L)、L亮氨酸(M)、L賴氨酸(N)、L苯丙氨酸(O)和L酪氨酸(P)共15個因子作兩水平因子設計實驗，影響因子的濃度范圍分別為50～200μg/L，30～110、10～60、10～60、15～70、25～90、20～80、5～50、20～80、20～80、25～90、25～90、15～70、10～60和5～50mg/L，設計表中采用“-1”、“0”和“1”分別表示對應影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。

(1)兩水平因子設計該設計可從大量影響因子中快速找出顯著影響因子，設計方案和結果如表1所示。

用軟件進行分析，得知設計模型的F值為18.05，由于噪聲影響而出現大于F值的概率僅為0.02%，故本設計模型是顯著的。A(D生物素)、B(L谷氨酸)、E(L纈氨酸)、H(L蛋氨酸)、M(L亮氨酸)和P(L酪氨酸)的F值分別為46.2、13.87、12.83、6.82、11.42和17.16，由于噪聲影響而出現比各自F值大的概率在5%以下，故它們對模型的影響顯著。曲率的F值為19.62，出現比F值大的幾率僅為0.16%，說明模型的響應曲面圖顯著彎曲，提示模型具有很強的顯著性。鑒于此，選擇生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作為影響發酵生產林可霉素的關鍵因素，進行響應面設計。其他可信度較小的因素對林可霉素的發酵生產無顯著影響，在下一步的培養基優化中不予考慮。表1兩水平因子設計和實驗結果

(2)響應面設計將6個顯著影響因子進行響應面設計中的中心組合設計(centralcompositedesign，CCD)，可得出響應值(生物效價)關于各顯著影響因子的多項二次擬合方程，再對響應面進行分析，可得響應值與各因子之間、因子與因子之間的相互關系，經過綜合分析得出整個響應區域中響應值的最優值和影響因子含量的最佳組合。

①中心組合設計6個顯著影響因子D生物素(a)、L谷氨酸(b)、L纈氨酸(c)、L蛋氨酸(d)、L亮氨酸(e)和L酪氨酸(f)的濃度范圍分別為30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。設計方案和實驗結果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分別表示對應影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。

方差分析結果如表3所示。該模型的F值為61.79，比F值大的幾率僅為0.01%，說明該模型是顯著的；由于ab、ad、ae、af、bc、cd、ce和ef各項的F值均比較大，大于各自F值的概率均在5%以下，故這些交互項對模型的影響是顯著的；ac項大于其F值的概率為5.22%，由于纈氨酸(c)在玉米漿中含量較多，它對微生物的生長有刺激作用，也可認為ac項對模型的影響是顯著的；失擬項的F值僅為0.25，比模型的F值要小得多，實驗數據與模型不相符的情況不顯著，提示本設計模型能充分反映實際情況。表2響應面設計和實驗結果表3方差分析表

軟件分析得知，模型的擬合度(RSquared)為0.997，說明預測值與實測值之間具有高度的相關性；校正決定系數(AdjRSquared)為0.9809，說明該模型能解釋98.09%響應值(Titres)的變化,僅有總變異的1.91%不能用此模型來解釋；模型的信噪比(AdeqPrecision)為23.723，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進一步說明本模型設計是非常成功的。

②分析與優化利用軟件對生物效價預測值與顯著影響交互項ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之間的響應面圖進行分析，得知上述交互作用項對生物效價的影響很大，在低濃度范圍內，生物素濃度越低，生物效價的預測值越大；谷氨酸和纈氨酸之間、纈氨酸和亮氨酸之間以及亮氨酸和酪氨酸之間對生物效價的影響具有顯著的正協同效應；纈氨酸和蛋氨酸對生物效價的影響存在拮抗效應，纈氨酸濃度較高和蛋氨酸濃度較低時，預測效價值較高。

對上述結果進行分析可知，低濃度的生物素對林可鏈霉菌的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝有促進作用；林可鏈霉菌對谷氨酸的需求量較高，可能是因為其參與較多的脫氨基和轉氨基反應，生成了較多的α酮戊二酸等中間產物，一方面對三羧酸循環有強化作用，另一方面可為林可霉素的生成提供豐富的中間產物；纈氨酸和亮氨酸為分支氨基酸，它們脫氨基可生成支鏈脂肪酸，對林可鏈霉菌的生長有刺激作用；酪氨酸為林可霉素A合成的前體，補入適量的前體，可提高林可霉素A的合成速率和產量；蛋氨酸為去甲基林可胺轉甲基反應的甲基供體，它對林可霉素的合成速率可能具有較大的限制作用，而纈氨酸對林可霉素的生長具有刺激作用，菌體生長與林可霉素的合成在某種程度上說是一種相互制約的關系，這樣就表現為蛋氨酸和纈氨酸之間的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有較高的菌濃，故培養基中應適當增加纈氨酸的濃度，相應適當降低蛋氨酸的濃度。

應用DesignExpert7.0軟件進行優化分析，得到生物效價的最大預測值為2275μg/ml，對應的D生物素、L谷氨酸、L纈氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸的濃度為：30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L。由江西國藥廠林可鏈霉菌L427發酵得到的林可霉素產品中B組分含量很低，所以本研究未用HPLC測定B組分含量。

2.3驗證實驗

為了檢驗優化結果的有效性，在搖瓶中同步進行了優化組、對照組I(培養基中無生物素和氨基酸)和對照組II(培養基中按原配方加入6個顯著影響因子)的驗證實驗，結果如表4所示。

3結論

在化學合成培養基中用林可鏈霉菌發酵生產林可霉素，通過兩水平因子設計實驗對生物素和氨基酸組分進行篩選，得出六個對生物效價有顯著影響的因子：D生物素、L谷氨酸、L纈氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸；通過響應面設計實驗和軟件的優化分析表4驗證實驗設計與結果

a：發酵培養基配方為原始配方(材料與方法)與表4配方的組合；b：生物效價為每組3個平行樣的平均值。

得到上述六個顯著影響因子的含量分別為30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L時，最終發酵液的最大預測效價為2275μg/ml。

采用優化配方進行搖瓶實驗，最終發酵液的生物效價為2116μg/ml；而采用對照I和II配方進行搖瓶實驗，最終發酵液的生物效價分別為893和1481μg/ml，即采用優化配方相對于采用對照I和II配方在生物效價方面提高的百分含量分別為136.62%和42.88%。

【參考文獻】

［1］SpizekJ,RezankaT.Lincomycin,clindamycinandtheirapplications［J］.ApplMicrobiolBiotechnol,2004,64(4):455～464.

［2］周倜，亓平言，苗秀，等.林可霉素提取過程生產現狀和研究進展［J］.國外醫藥抗生素分冊，1999，20(2)：61～64.

［3］LiN,SongJF,GuoW,etal.Studyandapplicationofparallelcatalytichydrogenwaveoflincomycininthepresenceofpersulfate［J］.MicrochemJ,2004,77(1):23～28.

［4］PeschkeU,SehmidtHZ,ZhangH,etal.MolecularcharacterizationofthelincomycinproductiongeneclusterofStreptomyceslincolnensis7811［J］.MolMicrobiol,1995,16(6):1137～1156.

［5］SpizekJ,RezankaT.Lincomycin,cultivationofproducingstrainsandbiosynthesis［J］.ApplMicrobiolBiotechnol,2004,63(5):510～519.

［6］KuoMS,YurekDA,CoatsJH,etal.Isolationandidentificationof3propylidenedelta1pyrroline5carboxylicacid,abiosyntheticprecursoroflincomycin［J］.JAntibiot(Tokyo),1992,45(11):1773～1177.

［7］YoungMD,KempeLL,BaderFG.Effectsofphosphate,glucoseandammoniumoncellgrowthandlincomycinproductionbyStreptomyceslincolnensisinchemicallydef

inedmedia［J］.BiotechnolBioeng,1985,27(3):327～333.

［8］金，楊蘊劉，焦瑞身.林肯鏈霉菌合成林可霉素代謝調節的研究［J］.生物工程學報，1998，14(1)：101～105.

［9］李小兵.林可霉素發酵過程中磷的調控［J］.中國醫藥工業雜志，1999，30(6)：246～248.

［10］LiXB,ZhaoGR,ZhengH,etal.Improvedindustrialfermentationoflincomycinbyphosphorusfeeding［J］.ProcessBiochem,2007,42(4):662～668.

［11］陳堅，堵國成，衛功元，等.微生物重要代謝產物發酵生產與過程解析［M］.北京：化學工業出版社，2005.

［12］潘林，孫建義.生物素的生理功能及其分子作用機制［J］.中國飼料，2005，(6)：21～24.

［13］王鏡巖，朱圣庚，許長法，等.生物化學(第三版)［M］.北京：高等教育出版社，2003.

［14］儲炬，李友榮.現代工業發酵調控學［M］.北京：化學工業出版社，2002.

［15］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)附錄Ⅺ［S］.北京：化學工業出版社，2005.

［16］RaoKJ,KimCH,RheeSK.StatisticaloptimizationofmediumfortheproductionofrecombinanthirudinfromSaccharomycescerevisiaeusingresponsesurfacemethodology［J］.ProcessBiochem,2000,35(9):639～647.新晨