用慶大霉素抗性篩選法選育西羅莫司高產(chǎn)菌株范文

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【摘要】用紫外線對吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NP03進行誘變，再采用慶大霉素抗性篩選法進行處理，劑量分別為0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml，共獲得113株抗性突變株，其中西羅莫司產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的有51株，突變株NP0374#的生產(chǎn)能力達(dá)到出發(fā)菌株的134%，且遺傳特性穩(wěn)定。

【關(guān)鍵詞】西羅莫司；慶大霉素；抗性篩選；遺傳穩(wěn)定性

Screeningofmutantoverproducingsirolimuswith

gentamicinresistancemethod

ZhangLiandJiaXiaojing

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,NorthChinaPharmaceulicalCo.,Shijiazhuang050015)

ABSTRACTAfterthesporesofStreptomyceshygroscopicusNP03beingtreatedwithUV,asamutagenonehundredthirteensirolimusproducingstrainswereobtainedbygentamicinresistancescreening.Thetreatmentdosewas0,0.01,0.03,0.05and0.08μg/mgrespectively.Thesirolimusyieldsof51mutantswerehigherthanthatoftheoriginalstrain.Amongthem,theyieldof#NP0374was134%ashighasoriginalstrain′s,andthecharacteristiccanbesteadilyinherited.

KEYWORDSSirolimus;Gentamicin;Resistancescreening;Hereditarystability

免疫抑制劑在器官移植排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療中有極其重要的作用。自20世紀(jì)70年代環(huán)孢素A用于臨床以來，器官移植的成功率大大提高，但探求新的、安全有效的免疫抑制劑的工作一直在繼續(xù)。

西羅莫司(sirolimus)是由吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，1977年Morris等首先發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制作用，1989年開始把西羅莫司作為治療器官移植的排斥反應(yīng)的新藥進行使用，臨床應(yīng)用顯示它具有很好的抗排斥作用，與環(huán)孢菌素A和他克莫司(FK506)等免疫抑制有良好的協(xié)同作用，是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑［1，2］。西羅莫司除用于器官移植抗排斥藥物外，還可用于抗真菌、心血管支架涂料、新合成抗腫瘤抗生素CCI779的原料藥，預(yù)防和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴型糖尿病等，應(yīng)用前途廣泛。

本文報道用慶大霉素對西羅莫司產(chǎn)生菌進行處理，以獲得高產(chǎn)的抗性菌株。

1材料與方法

1.1出發(fā)菌株

吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NP03(本實驗室保存)。

1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(%)酵母膏0.1，牛肉膏0.1，葡萄糖1.0，瓊脂1.5。

斜面培養(yǎng)基天門冬素瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(%)淀粉2.0，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.3；pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)葡萄糖3.0，黃豆餅粉3.0，硫酸銨0.5，淀粉1.0，碳酸鈣0.3；pH自然。

1.3主要儀器

旋轉(zhuǎn)式搖瓶機，高速離心機，Waters高效液相色譜儀。1.4菌種的選育方法

(1)制備單孢子懸液取NP03菌株的新鮮斜面，加無菌水制成孢子懸液，脫脂棉過濾，收集單孢子懸液，調(diào)整其濃度為106個/ml。

(2)誘變處理

紫外線誘變將其孢子懸液置于15W紫外燈40cm處分別照射0、10、20和30s，然后稀釋分離，培養(yǎng)。計數(shù)并統(tǒng)計致死率，確定紫外處理時間。

慶大霉素抗性突變株的篩選將用紫外誘變過的孢子懸液稀釋成不同濃度，分別涂布在含有0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml慶大霉素的分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)10～16d，計數(shù)，統(tǒng)計致死率；挑取不同濃度下及對照組的菌落，培養(yǎng)后進行搖瓶初篩和復(fù)篩。

1.5效價測定

高壓液相外標(biāo)法。

2結(jié)果與分析

2.1最佳照射劑量的選擇

考察紫外線照射時間對菌株致死率的影響(Tab.1)。

紫外線有較強的殺菌能力和誘變能力，從Tab.1可以看出，NP03菌株對紫外的耐受力較弱，30s的致死率幾乎達(dá)到100%，20s的致死率達(dá)到75.8%，為保證有較高的篩選幾率，選擇20s的UV照射劑量。

2.2UV照射后慶大霉素劑量對菌株的影響

由Fig.1可知NP03菌株對慶大霉素比較敏感，20s紫外照射后的菌株與慶大霉素的濃度存在著劑量效應(yīng)，當(dāng)慶大霉素的劑量為0.01μg/ml時的致死率是90.2%，0.03μg/ml的致死率是92.5%，0.05μg/ml時致死率已為97.8%，0.08μg/ml的致死率是99.9%。

2.3用慶大霉素抗性篩選西羅莫司高產(chǎn)菌株

出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變和慶大霉素處理，在選擇平板上隨機挑選出113個菌落，搖瓶初篩后有51株的發(fā)酵效價比出發(fā)菌株高，有2株超過原始菌株30%以上，它們的產(chǎn)量分布見Fig.2，其中突變株NP0374#高出對照菌株34%，HPLC的分析圖譜見Fig.3。

2.4高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性的考察

將突變株NP0374#傳4代，培養(yǎng)好后各代子斜面同時進行搖瓶，考察相對效價的變化。Tab.2顯示該菌株傳代后效價無明顯變化，遺傳穩(wěn)定性較好。

3討論

在微生物菌種選育中，紫外線誘變處理，方法簡便，效果好，被廣泛采用。抗性突變株的篩選也是獲得高產(chǎn)菌株一種有效的的育種方法。抗性突變包括抗代謝產(chǎn)物、抗噬菌體、抗前體及其類似物、抗重金屬離子或抗特定的有毒物質(zhì)［3］、抗培養(yǎng)基中的某些成分等。篩選的抗性突變株可以消除不利因素的抑制或阻遏作用，達(dá)到積累目的產(chǎn)物的作用。由于抗生素產(chǎn)生菌的抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因緊密連鎖而易發(fā)生共突變［4］，所以易獲得高產(chǎn)突變株。丁向東［5］采用卡那霉素抗性篩選的方法，江凌等［6］采用鏈霉素抗性突變方法均獲得了萬古霉素高產(chǎn)突變株；強華等［7］采用慶大霉素、絲裂霉素C、紅霉素、亞硝基胍處理吸水鏈霉素FC904原生質(zhì)體，獲得了用慶大霉素處理效果較好的高產(chǎn)菌株；胡海峰等［8］用組合慶大霉素到利福平二種抗性突變大幅度提高了FR900493產(chǎn)量。

本實驗室通過抗性篩選法結(jié)合傳統(tǒng)的紫外線誘變方法可以快速、有效地獲得理想的抗生素高產(chǎn)菌株這一思路，對吸水鏈霉菌NP03用紫外和慶大霉素處理后，獲得了產(chǎn)量提高34%的高產(chǎn)菌株NP0374#，且遺傳性穩(wěn)定。

【參考文獻】

［1］StepkowskiSM,ChenH,DalozeP,etal.Rapamycin,apotentimmunosuppressidrugforvascularizedheart,kidney,andsmallboweltransplantationintherat［J］.Transplantation,1990,51(1):22～26.

［2］GrangerDK,CromwellJW,ChenSC,etal.Prolongationofrenalallograftsurvivalinalargeanimalmodelbyoralrapamycinmonotherapy［J］.Transplantation,1995,9(2):183～186.

［3］曹有聲，劉仲敏.現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)［M］.長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

［4］王付轉(zhuǎn)，梁秋霞，李宗偉，等.誘變和篩選方法在微生物育種中的應(yīng)用［J］.洛陽師范學(xué)院學(xué)報，2002，21(2)：95～99.

［5］丁向東.萬古霉素的研究開發(fā)［D］.上海：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，1998.

［6］江凌，鄔建國，陳偉偉，等.鏈霉素抗性突變——萬古霉素高產(chǎn)菌株的選育研究［J］.中國抗生素雜志，2005，30(2)：70～72.

［7］強華，黃捷，陳貽鍇，等.抗生素、亞硝基胍處理吸水鏈霉素FC904原生質(zhì)體對雷帕霉素產(chǎn)量的影響［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999，33(3)：289～292.

［8］胡海峰，張琴，朱寶朱，等.組合慶大霉素和利福平抗性突變提高蠟狀芽孢桿菌2045合成抗生素FR900493的水平［J］.中國抗生素雜志，2003，28(1)：53～54.新晨