細菌整合子進展范文

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【摘要】整合子是近年來在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種可移動性基因元件，通過位點特異性重組捕獲并表達外源性基因盒，是導(dǎo)致耐藥基因在細菌間水平播散的重要原因。本文就整合子的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、分類；基因盒的結(jié)構(gòu)、來源；整合子對基因盒的捕獲、剪切與表達；整合子與細菌耐藥性的關(guān)系以及整合子的檢測等方面進行綜述。

【關(guān)鍵詞】整合子；基因盒；耐藥基因；耐藥性

ABSTRACTIntegronsaremobileDNAelementsthatwerefoundinbacteriarencently.Bycapturingexogenousgenecassettesthroughsitespecificrecombinationandensuringtheexpressionofgenescontainedingenecassettes,integronsplayedimportantrolesinthehorizontaldisseminationofdrugresistancegenesinbacteria.Thispaperrevieweddiscovery,structureandclassificationofintegrons,structureandoriginsofgenecassettes,thecapture,deletionandexpressionofgenecassettesbyintegrons,therelationshipbetweenintegronsanddrugresistance,andthedetectionofintegrons.

KEYWORDSIntegron;Genecassette;Drugresistancegene;Drugresistance

隨著抗生素的廣泛使用，細菌在抗生素的選擇壓力下耐藥菌株不斷產(chǎn)生，其中細菌通過基因的水平轉(zhuǎn)移，獲得外源性耐藥基因是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因。與細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的遺傳結(jié)構(gòu)有質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體以及近年來在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然的克隆表達系統(tǒng)［1］——整合子(integron)。整合子通過位點特異性重組捕獲外源基因盒(genecassettes)并使之表達，同時整合子可位于質(zhì)粒上，或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而參與轉(zhuǎn)移［2］，使耐藥基因發(fā)生播散。整合子因其在細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到研究者的關(guān)注。

1整合子的發(fā)現(xiàn)

19世紀(jì)80年代研究者在對耐藥質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進行系統(tǒng)研究時，發(fā)現(xiàn)在R100(Tn21)、R46(IncN)、R388(IncW)、pLMO20、pSa等不同來源相互獨立的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，不同耐藥基因兩側(cè)的序列具有相似的限制性酶切圖譜，推測其可能是一個移動性基因元件［3～5］。1989年Stokes等［5］通過比對Tn21的aadA和R46的oxa2aadA兩側(cè)的序列并結(jié)合限制性酶切圖譜，初步確定了3′保守末端和5′保守末端的范圍。由于保守末端的外緣不具有反向末端重復(fù)序列、正向末端重復(fù)序列或靶位點重復(fù)序列等轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特點，認為其是一種新的移動性基因元件并建議將其命名為“DNA整合元件”(DNAintegrationelements)或簡稱為“整合子”。

2整合子的結(jié)構(gòu)和分類

2.1整合子的結(jié)構(gòu)

整合子的結(jié)構(gòu)如圖1所示，由3個部分組成：5′保守末端(5′conservedsegment,5′CS)、3′保守末端(3′conservedsegment,3′CS)和兩者之間的可變區(qū)(variableregion)。5′CS是整合子的基本結(jié)構(gòu)，包括編碼整合酶(integrase,IntI)的基因(intI)、整合子重組位點attI和整合子可變區(qū)啟動子(Pant)［6］。IntI屬于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在整合子重組位點attI和基因盒重組位點attC之間的整合和剪切。整合酶基因帶有自己的啟動子Pint。attI位于整合酶基因的上游，是外源基因盒整合到整合子上的位點。啟動子Pant指導(dǎo)下游可變區(qū)中自身不帶有啟動子的基因盒中基因的表達。啟動子Pant的方向與Pint的方向相反。可變區(qū)帶有不同數(shù)量和功能的基因盒，但可變區(qū)并不是整合子的基本結(jié)構(gòu)，有的整合子在5′CS和3′CS之間沒有基因盒插入［7］。3′CS因整合子的種類不同而異。

2.2整合子的分類

整合子常根據(jù)intI基因DNA序列的不同進行分類，研究較多的主要有以下4類：

第一類整合子最常見，從臨床菌株中發(fā)現(xiàn)的整合子大多屬于此類。其整合酶IntI1含有337個氨基酸。5′CS有編碼IntI1的基因intI1、重組位點attI1和啟動子Pant。其中Pant位于IntI1的編碼框內(nèi)，有的整合子還有啟動子P2［1］。大多數(shù)第一類整合子的3′CS包括3個開放讀碼框(ORF)：磺胺耐藥基因(sul1)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因(qacE△1)及功能不明的ORF5［8］。可變區(qū)帶有不同數(shù)量的基因盒，大部分是編碼各種抗生素抗性的耐藥基因盒。

第二類整合子存在于Tn7或它的衍生物上，其整合酶基因intI2被一個終止密碼子中斷，是缺陷的整合酶基因，它的產(chǎn)物IntI2約有318個氨基酸，與IntI1有40%的同源性［9，10］。IntI2不能催化基因盒的整合與剪切。目前僅發(fā)現(xiàn)核苷轉(zhuǎn)移酶基因aadAla、甲氧芐啶耐藥基因dhfr及鏈絲霉素耐藥基因sat位于該類整合子上。現(xiàn)已在沙門菌、志賀菌和不動桿菌中發(fā)現(xiàn)第二類整合子。

第三類整合子最初由Arakawa在耐碳青霉烯類抗生素的粘質(zhì)沙雷菌的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的，其整合酶IntI3有346個氨基酸，與IntI1有60.9%的同源性。目前僅在粘質(zhì)沙雷菌、肺炎克雷伯菌等細菌中分離出第三類整合子，只發(fā)現(xiàn)碳青霉烯耐藥基因位于該整合子上［11，12］。

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nbsp;以上三類整合子與細菌耐藥基因的播散密切相關(guān)，常被合稱為耐藥整合子(resistanceintegron，RI)。

第四類整合子是Mazel等［13］在霍亂弧菌基因組中首次發(fā)現(xiàn)，其整合酶IntI4有320個氨基酸，與前三類整合子的整合酶有45%～50%的同源性。此類整合子的可變區(qū)可帶有上百個基因盒，故又稱為超級整合子(superintegron，SI)。SI基因盒中的基因除了與細菌耐藥有關(guān)外，還與細菌的代謝和毒力有關(guān)［14］。除霍亂弧菌外,在梅氏弧菌、費氏弧菌、擬態(tài)弧菌等細菌的染色體基因組中也發(fā)現(xiàn)了超級整合子。

此外，可根據(jù)整合子是否具有可移動性將整合子分為移動性整合子(mobileintegrons)和超級整合子［14］。移動性整合子與移動性基因元件結(jié)合在一起，可伴隨移動性基因元件一起移動，與細菌耐藥基因的播散密切相關(guān)。超級整合子位于染色體上并成為染色體的一部分而不能自由移動。

3基因盒的結(jié)構(gòu)和來源

3.1基因盒的結(jié)構(gòu)

基因盒是一種可移動性基因元件，可以環(huán)狀的形式獨立存在，也可整合入整合子中而成為整合子結(jié)構(gòu)的一部分［1］。基因盒的結(jié)構(gòu)如圖2，由單一基因(結(jié)構(gòu)基因)和一個整合位點attC組成。由于第一個被發(fā)現(xiàn)的attC長度為59bp，所以attC又稱為59堿基元件(59baseelements，59be)。第四類整合子的attC位點稱為霍亂弧菌重復(fù)序列(Vibriocholerarepetitivesequences，VCRs)。attC位點的長度為57～141bp，是一個不完全的反向重復(fù)序列，并含有可被整合酶識別的特異性整合位點。attC位點的兩端分別為一7堿基對的保守片段，分別稱為核心位點(coresite，CS)和反向核心位點(inversecoresite，ICS)。核心位點的共同序列為GTTRRRY(R：嘌吟，Y：嘧啶)，核心位點位于attC位點的右側(cè)，互補的反向核心位點序列為RYYYAAC，位于attC位點的左側(cè)。當(dāng)游離的環(huán)狀基

A：環(huán)狀基因盒；B：線性基因盒

圖2基因盒的結(jié)構(gòu)(重組位點用垂直箭頭標(biāo)出)

因盒在整合酶的催化下與整合子的attI發(fā)生位點特異性重組時，重組交換發(fā)生在attC核心位點GTT中的G和第一個T之間，核心位點GTT及G左側(cè)堿基突變對整合頻率影響較大［15］。

3.2基因盒的來源

基因盒的起源至今還不清楚。由于大多數(shù)基因盒中的結(jié)構(gòu)基因都沒有自己的啟動子，同時attC的不完全反向重復(fù)序列可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，類似于不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)［16］，推測基因盒是由mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄而來。重組位點可能是原始轉(zhuǎn)錄的mRNA一部分，也可能是在mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后加的序列［17］。此種假說還有待于從細菌中分離出適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄酶來加以確證。

由于(1)SI中基因盒的重復(fù)序列VCRs具有種屬特異性，而RI中基因盒的attC位點高度可變；(2)RI中一些基因盒的序列與SI中基因盒序列完全一致；(3)SI中的基因盒可被IntI1識別［13］，研究者推測RI中基因盒可能來源于SI。

此外，Stokes等［18］設(shè)計針對59be保守序列的引物對自然環(huán)境中的樣品進行PCR擴增，在來自不同地點的樣品中擴增出不同的基因盒，許多功能未知。提示自然環(huán)境中的微生物可能為整合子中基因盒的來源提供龐大的儲備庫。

4整合子對基因盒的捕獲、剪切與表達

4.1整合子對基因盒的捕獲與剪切

游離的的環(huán)狀基因盒在整合酶的催化下通過位點特異性重組整合于整合子上，成為整合子的一部分，同時位于整合子上的基因盒也可在整合酶的催化下形成環(huán)狀基因盒而從整合子中剪切下來［7，19，20］，如圖3。

重組位點用垂直箭頭標(biāo)出；來源于環(huán)狀基因盒1的核心位點用大寫

字母表示；來源于環(huán)狀基因盒2的核心位點用小寫字母表示

圖3整合子對基因盒的捕獲與剪切第一類整合子對基因盒的捕獲與剪切研究較多。整合酶IntI1中4個保守氨基酸分別是第146位和第280位的兩個精氨酸、第277位的組氨酸和第312位的酪氨酸，與整合酶的活性密切相關(guān)［21，22］。IntI1主要識別兩個位點：整合子上的attI1和基因盒上的attC。

attI1位點比較保守，其長度至少40bp，全功能需70bp，在5′CS內(nèi)緣有一個核心位點GTTRRRY而無反向核心位點。重組位點也位于核心位點GTT中的G和第一個T之間［1，23］。Collis等［24］發(fā)現(xiàn)IntI1主要與雙鏈attI1結(jié)合，重組位點左側(cè)第24～37bp的14bp是IntI1的強結(jié)合位點，此區(qū)域在位點特異性重組中具有重要作用。一個不完全正向重復(fù)序列位于重組位點左側(cè)第41～55bp的區(qū)域，是IntI1的弱結(jié)合位點。Gravel等［25］發(fā)現(xiàn)attI1位點上有4個IntI1結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中3個結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有GTTA保守序列。

attC位點序列和長度多變，包含兩對不完全反向重復(fù)序列和中間的回文區(qū)，單鏈可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。attC含有4個IntI1結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括核心位點、反向核心位點和兩者之間的一對不完全反向重復(fù)序列。IntI1與attC單鏈(bottom鏈)結(jié)合能力強，提示IntI1介導(dǎo)的重組僅有一條鏈交換發(fā)生［14，26，27］。

整合酶介導(dǎo)的基因盒的整合主要發(fā)生在attC和attI之間，稱為特異性整合。同時整合酶也可介導(dǎo)attC和attI以外的第二位點的整合，稱為非特異性整合，雖然整合頻率較低，但因其周圍只有一個重組位點而不能被切除，其在細菌基因組、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子進化中起重要作用［28］。整合酶介導(dǎo)的基因盒的剪切主要發(fā)生在兩個attC位點之間。

目前僅知道整合酶在整合子對基因盒的整合與剪切起重要作用，由于體外整合和剪切反應(yīng)體系尚未成功建立，是否有其它因子如輔助蛋白等參與還有待于進一步研究。

4.2基因盒的表達

大多數(shù)基因盒沒有自己的啟動子，基因盒總是以5′→3′的方向整合入整合子，使其可以在上游整合子可變區(qū)啟動子Pant的作用下得以表達，有的整合子在Pant下游還有啟動子P2［1］。目前研究的4種Pant和2種P2的結(jié)構(gòu)和相對啟動強度見表1［8］。

影響基因盒表達的因素主要有：(1)基因盒上游Pant或P2的強弱；(2)基因盒距離啟動子的遠近，處于基因盒隊列下游的基因盒表達相對較弱，因其上游基因盒的attC具有類似于不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)［16］；(3)對于非特異性整合的基因盒是否表達要看其上游是否有適當(dāng)?shù)膯幼哟嬖冢?4)位于質(zhì)粒上的表1整合子啟動子Pant和P2的結(jié)構(gòu)和相對啟動強度

啟動子35區(qū)10區(qū)間隔(堿基數(shù))強度PantTTGACATAAACT17強TGGACATAAGCT17弱TGGACATAAACT17混合1TTGACATAAGCT17混合2P2TTGTTATACAGT14無活性TTGTTATACAGT17未知

整合子中基因盒的表達水平還與質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)；(5)少數(shù)基因盒如cmlA帶有自己的啟動子和弱化信號［1］，其表達不受上游啟動子和基因盒的影響。

此外，第一類整合子Pant位于Pint的下游，轉(zhuǎn)錄方向相對，兩者的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有一段互補序列，可能對基因盒和整合酶之間的表達起著調(diào)控作用。

5整合子與細菌耐藥性的關(guān)系

目前在第一類整合子中發(fā)現(xiàn)的基因盒已超過80種［14］，大部分是耐藥基因盒，編碼產(chǎn)物可賦予細菌對幾乎全部臨床常用藥物產(chǎn)生耐藥性。一個整合子可帶有多個耐藥基因盒，使細菌對多種藥物產(chǎn)生耐藥性。

整合子是一個可移動性基因元件，一方面整合子可通過對基因盒的捕獲和剪切使基因盒發(fā)生移動，另一方面整合子自身可位于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動基因元件上使整合子發(fā)生移動，使耐藥基因發(fā)生播散。

國內(nèi)外大量文獻報道整合子與細菌的耐藥性密切相關(guān)。Grape等［29］報道105株尿液標(biāo)本中分離的革蘭陰性細菌中59株(56.2%)整合子陽性，整合子陽性菌株平均對4.2種藥物耐藥，而整合子陰性菌株平均僅對1.9種藥物耐藥。Gombac等［30］檢測發(fā)現(xiàn)過去11年來分離自意大利6所不同醫(yī)院的36株鮑曼不動桿菌中第一類整合子陽性的有16株(44.4%)，其中13株具有相同的基因盒排列順序，表明整個整合子結(jié)構(gòu)可發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。Su等［31］對廣州市過去6年中分離的111株大腸桿菌臨床菌株進行整合子檢測，發(fā)現(xiàn)95株(85.7%)第一類整合子陽性，4株(3.7%)第二類整合子陽性，并在不同基因型的菌株中發(fā)現(xiàn)相同的基因盒dfrA17aadA5，表明基因盒可通過水平轉(zhuǎn)移在臨床菌株中播散。近年來在革蘭陽性細菌也檢測到整合子［8］，Shi等［32］報道46株分離自臨床標(biāo)本的革蘭陽性細菌中第一類整合子的陽性率為100%，表明第一類整合子也廣泛分布于革蘭陽性細菌中。在沒有抗生素壓力的自然環(huán)境中，整合子的檢出率很低，僅為3.6%，并且一半以上的整合子不攜帶耐藥基因盒［33］。提示整合子捕獲耐藥基因盒與抗生素的選擇壓力有關(guān)。

6整合子的檢測

目前整合子的檢測主要運用分子生物學(xué)的方法。由于第

一、

二、三類整合子與細菌耐藥密切相關(guān)，臨床菌株中整合子的檢測主要針對此三類整合子。

5′CS的檢測設(shè)計針對整合酶基因保守序列的引物進行PCR擴增整合酶基因片斷來對細菌進行整合子的篩查。除了普通PCR外，也有用多重PCR［31，34，35］設(shè)計三對引物同時擴增三種整合酶基因片斷，在篩查整合子的同時可對整合子進行分類。還可設(shè)計針對三種整合酶基因共同保守序列的簡并引物進行PCR，擴增產(chǎn)物再用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切后根據(jù)酶切圖譜進行分類［36］。也可用熒光定量PCR進行整合酶基因的快速檢測［37］。

3′CS的檢測由于大多數(shù)第一類整合子的3′CS有sul1基因，可用引物擴增sul1基因來進行第一類整合子的篩查。由于有的第一類整合子沒有3′CS，所以此種方法檢測的陽性率要低于針對整合酶基因的PCR。

基因盒的檢測一般先用針對5′CS和3′CS的引物擴增整合子的可變區(qū)，再進行測序來確定基因盒的種類和排列順序。對于在大量臨床菌株中進行整合子的分子流行病學(xué)調(diào)查時，可選擇有代表性的PCR產(chǎn)物片斷進行測序，根據(jù)測序結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對相同大小的PCR產(chǎn)物片斷進行酶切，具有相同酶切圖譜的片斷可初步認為序列相同［38］。由于可變區(qū)片斷大小未知，有的可變區(qū)長度大于PCR擴增能力，因此易出現(xiàn)假陰性。也可直接擴增相應(yīng)的基因盒或用針對相應(yīng)基因盒的探針與細菌基因組DNA酶切片斷進行Southern雜交，來檢測相應(yīng)的基因盒。

另外可用特異性探針分別與細菌基因組DNA酶切片斷和質(zhì)粒DNA進行Southern雜交來進行整合子的定位［39］。將整合子可變區(qū)或基因盒克隆至適當(dāng)?shù)妮d體上來對基因盒的功能進行研究等。

7結(jié)語

早在1888年臨床分離的菌株中就已存在SI［13］，表明整合子是一個古老的結(jié)構(gòu)，是細菌進化的產(chǎn)物。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化，不適應(yīng)細菌生存時，細菌通過整合酶催化的位點特異性重組，捕獲外源基因盒或使自身的基因盒發(fā)生剪切與重排，同時使下游基因盒得以表達來適應(yīng)外界環(huán)境的變化。整合子的發(fā)現(xiàn)一方面為細菌耐藥性的控制帶來困難，另一方面也為細菌耐藥機制的研究提供了新的思路。隨著研究的深入，許多方面值得進一步探討：①整合子整合和剪切基因盒的確切機制有待于體外整合和剪切反應(yīng)體系的建立；②整合子中基因盒的起源；③整合酶表達和基因盒基因表達之間的關(guān)系；④整合子在細菌進化中的作用；⑤快速簡便的整合子檢測方法的建立等。

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