MHCC97中邊緣群細(xì)胞成瘤性及其侵襲性觀察范文

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作者：張毅，竇科峰，宋文杰，霍斌亮，張福琴

【摘要】目的:分離肝癌細(xì)胞系mhcc97中邊緣群細(xì)胞并觀察其成瘤性和侵襲性.方法:利用流式細(xì)胞熒光激活分選法將肝癌細(xì)胞系MHCC97分成邊緣群(SP)和主群(MP)細(xì)胞兩個(gè)亞群.對(duì)兩個(gè)亞群細(xì)胞分別采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤試驗(yàn)觀察其體內(nèi)外成瘤能力；Transwell小室法檢測(cè)兩個(gè)亞群細(xì)胞的體外侵襲力.結(jié)果:SP細(xì)胞的體外克隆形成率為57%，MP細(xì)胞僅為13%；1×103個(gè)SP細(xì)胞可在4wk后形成明顯的皮下移植瘤(2/8)，MP細(xì)胞則需1×105個(gè)才能成瘤(2/8).Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，SP表型細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)為(66.6±4.0)個(gè)，MP表型細(xì)胞僅為(18.2±1.9)個(gè).結(jié)論:肝癌細(xì)胞系MHCC97中SP亞群的成瘤性和侵襲性均強(qiáng)于MP亞群細(xì)胞，表明SP表型的細(xì)胞在肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中具有重要的地位.

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；邊緣群；腫瘤干細(xì)胞；侵襲

0引言

目前對(duì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間關(guān)系的研究表明：惡性腫瘤是由一小群具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcell,CSC)［1］引起.CSC在腫瘤形成、生長(zhǎng)以及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著決定性作用.我們采用流式細(xì)胞熒光激活分選肝癌細(xì)胞系MHCC97中邊緣群(SP)亞群和主群(MP)亞群并研究其成瘤性和侵襲性.初步分析邊緣群細(xì)胞與肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系.

1材料和方法

1.1材料MHCC97細(xì)胞系(人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系)購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所.裸小鼠(BALB/c)48只，雌雄兼用，4～6wk齡，體質(zhì)量l5～18g（本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心）；DMEMF12培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco公司)；Hoechst33342、維拉帕米、碘化丙錠(PI)(Sigma公司)；FACSAdvantageII型六色熒光流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Transwell小室(Costar公司)；Matrigel（BD公司)；纖維粘連蛋白(Sigma公司).

1.2方法

1.2.1MHCC97細(xì)胞培養(yǎng)用含100mL/L小牛血清,1×105u/L青霉素,1×105u/L鏈霉素的DMEMF12培養(yǎng)液,在37℃，50mL/LCO2飽和濕度條件下培養(yǎng)MHCC97細(xì)胞,2.5g/L胰蛋白酶消化液消化、傳代,實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞.

1.2.2SP，MP細(xì)胞的分選①細(xì)胞染色：胰酶消化MHCC97細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L.加入熒光染料Hoechst33342使終濃度為6mg/L.取1/10體積加好染料的細(xì)胞懸液加入維拉帕米，終濃度50μmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min.分選前制備成單細(xì)胞懸液，加入PI至終濃度為2mg/L.②流式細(xì)胞儀檢測(cè)：355nmUV激發(fā)光源，610nm雙色短通反射濾鏡，450nm和675nm邊緣長(zhǎng)通濾片分別檢測(cè)散射光藍(lán)光及紅光部分.測(cè)量前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)二維參數(shù)圖，檢測(cè)細(xì)胞均一性，以Hoechstred為X軸，Hoechstblue為Y軸作二維散點(diǎn)圖，將低Hoechstred及低Hoechstblue且維拉帕米組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的“門(mén)”，計(jì)算百分比，分選出SP，MP細(xì)胞.

1.2.3雙層軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)于24孔板中,下層低熔點(diǎn)瓊脂濃度為6g/L,上層為3g/L,每孔上層低熔點(diǎn)瓊脂含細(xì)胞數(shù)為100個(gè),SP，MP細(xì)胞各鋪5孔.在37℃，50mL/LCO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)2wk，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于100μm或含24個(gè)細(xì)胞以上的克隆.計(jì)算克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%.

1.2.4裸鼠成瘤試驗(yàn)將分選的SP，MP細(xì)胞計(jì)數(shù)，倍比稀釋法調(diào)整濃度，按1×105，1×104，1×103的數(shù)量行裸鼠背部皮下接種注射，每個(gè)濃度組8只，每3d觀察1次腫瘤形成情況及測(cè)量腫瘤大小,連續(xù)觀測(cè)4wk.

1.2.5細(xì)胞侵襲力檢測(cè)采用帶有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室，在濾膜的上下表面分別鋪以Matrigel和纖維粘連蛋白，上室加1×109/L腫瘤細(xì)胞懸液400μL，下室加入200μL條件培養(yǎng)液，于37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)24h，用棉簽擦去微孔膜上室面的細(xì)胞，甲醛固定，HE染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野中細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力.每組重復(fù)試驗(yàn)3次.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS12.0軟件處理.

2結(jié)果

2.1SP細(xì)胞和MP細(xì)胞的分選前向散射和側(cè)向散射二維參數(shù)圖分析癌細(xì)胞形態(tài)、大小、胞質(zhì)均勻性較一致，PI染色去除死細(xì)胞.Hoechst33342藍(lán)光和紅光的雙參數(shù)圖中SP細(xì)胞位于左下角兩種熒光均陰性或很弱的區(qū)域,無(wú)維拉帕米組SP細(xì)胞比例約為3.9%（圖1）,經(jīng)維拉帕米阻斷后SP細(xì)胞比例減少至0.5%.

2.2軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)SP和MP細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)2wk后均可見(jiàn)明顯的桑椹樣細(xì)胞克隆形成.但在細(xì)胞克隆的大小和克隆形成率上MP細(xì)胞明顯小于SP細(xì)胞.計(jì)數(shù)24個(gè)細(xì)胞以上的克隆細(xì)胞團(tuán)，SP組為57%，MP組僅為13%（圖2）.圖1流式細(xì)胞分選圖

A：SP；B：MP.

圖2MHCC97邊緣群（SP）和主群（MP）細(xì)胞15d形成的克隆×100

2.3裸鼠成瘤試驗(yàn)接種1×103的SP細(xì)胞便可在4wk后形成明顯的皮下移植瘤(2/8)；1×104SP組中有6只裸鼠成瘤；1×105SP組全部成瘤.MP細(xì)胞需1×105細(xì)胞才能形成皮下移植瘤(2/8)，1×104和1×103MP組均不能成瘤.在相同接種細(xì)胞數(shù)量的情況下，SP細(xì)胞形成的腫瘤體積大于MP細(xì)胞(圖3).常規(guī)HE染色可見(jiàn)裸鼠皮下腫瘤呈典型的移植瘤特點(diǎn).

2.4細(xì)胞侵襲力檢測(cè)SP表型細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)為（66.6±4.0）個(gè)，MP表型細(xì)胞僅為（18.2±1.9）個(gè).兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01).A:1×105SP;B:1×104SP;C:1×103SP;D:1×105MP.

圖3MHCC97邊緣群（SP）和主群（MP）細(xì)胞30d成瘤

3討論

目前利用干細(xì)胞通用分子標(biāo)記ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPbindingcassettetransporter)高效外排熒光染料的特性進(jìn)行SP細(xì)胞分選［2-3］.2004年，Kondo等［4］在C6，MCF7，Blo4和Hela4個(gè)細(xì)胞系中檢測(cè)到了SP細(xì)胞，并提示SP是適用于腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)與分選的一種方法.我們對(duì)肝癌細(xì)胞系MHCC97流式分選出SP和MP細(xì)胞兩個(gè)亞群.從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上看，無(wú)論是軟瓊脂克隆形成的體外實(shí)驗(yàn)還是裸鼠成瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，SP細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯強(qiáng)于MP細(xì)胞的增殖和成瘤能力.這與造血系統(tǒng)、人乳腺癌及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中腫瘤干細(xì)胞比非干細(xì)胞具有更高的成瘤潛能一致［5-6］.但實(shí)驗(yàn)中1×105MP組也有腫瘤形成，其原因可能是這種通過(guò)干細(xì)胞功能學(xué)標(biāo)志得到得SP亞群并不能代表所有的腫瘤干細(xì)胞.

Tu等［7］認(rèn)為干細(xì)胞的遷移和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移皆受特異化學(xué)因子及其受體的調(diào)節(jié).干細(xì)胞能夠遷移到特定的組織和器官，而這可以解釋腫瘤轉(zhuǎn)移也有一定器官和組織特異性.Ho等［8］也證實(shí)在肺癌中SP亞群細(xì)胞具有強(qiáng)于其它細(xì)胞的侵襲能力.目前利用Matrigel膠重建基底膜系統(tǒng)是體外研究腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為的簡(jiǎn)便且快速的方法［9］.細(xì)胞侵襲穿過(guò)重建Matrigel的能力反映該細(xì)胞的侵襲能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SP細(xì)胞24h穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)多于MP亞群.提示SP亞群細(xì)胞的存在可能是導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因之一.

我們的結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞系MHCC97中SP亞群細(xì)胞具有很強(qiáng)的成瘤性和侵襲性，也表明其具有一定的干細(xì)胞特性.與上述結(jié)論相關(guān)的具體分子機(jī)制及直接因果關(guān)系還有待進(jìn)一步探討，目前尚不能證明SP亞群中百分之百的細(xì)胞都具有干細(xì)胞特性，同時(shí)并非所有腫瘤干細(xì)胞都具有SP特性［10］.若結(jié)合其他干細(xì)胞表面標(biāo)志如Sca1，ckit，CK7，Thy1［11］可進(jìn)一步純化具有干細(xì)胞特性的肝癌細(xì)胞.總之，針對(duì)具有干細(xì)胞特性的SP亞群細(xì)胞的研究將在肝癌的治療中具有重要的臨床意義.

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