分子科學論文：腫瘤的分子科學研究趨向范文

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作者：李宏單位：重慶工商大學環境與生物工程學院

DNA和組蛋白的甲基化修飾

DNA甲基化同眾多疾病的發生與發展密切相關，特別是癌癥，其發生過程中癌細胞基因組整體的欠甲基化和局部區域的超甲基化是其典型特征。超甲基化體現在抑癌基因的啟動子區被異常甲基化，整體的欠甲基化同重復序列(如轉座子)以及癌基因的啟動子區的甲基化程度減小、基因組遺傳不穩定性的增加密切相關。研究特定癌癥中超甲基化基因的工作較多，包括乳腺癌、結腸癌、髓細胞性白血病、肝癌和卵巢癌等。隨著高通量分析手段如ChIP－on－chip和ChIP－seq最近的發展，現在研究者真正能夠在基因組尺度分析基因組－表觀組相互作用及其對基因表達的影響。一些用于表觀組分析的生物信息學軟件也已經開發出來，如EpiGRAPH和Galaxy，兩者結合起來可以證實富含SNP的啟動子的表觀遺傳學修飾。當然還有一些較大規模的DNA甲基化相關數據庫:如MethDB、MethyCancer、PubMeth和MethCancerDB。

MethDB和MethyCancer還提供了DNA甲基化的可視化工具。DNA甲基化是腫瘤的形成過程中可逆的表觀遺傳修飾，其過程是由DNA甲基化轉移酶(DNMT)來完成的。DNA甲基化轉移酶已成為目前DNA去甲基化恢復抑癌基因功能的熱點靶分子，通過DN-MT抑制劑，可以使腫瘤中許多超甲基化的基因被重新激活。如DNMT抑制劑5－氮胞苷(5－azacyti-dine)，能夠參與DNA的合成，通過阻斷DNMT在甲基化反應中的中間步驟，導致細胞的DNMT被迅速清除同時造成基因組DNA的去甲基。5－氮胞苷的脫氧核糖類似物，如5－aza－2＇－deoxycytidine(decitabine)、Fazarabine、zebularine等也具有DNMT抑制劑的作用。

Xu等分析了啟動子甲基化對BRCA1轉錄的影響，用5－aza－CdR和TSA瞬間處理UACC3199細胞系后，檢測到了BRCA1mRNA和BRCA1蛋白的重新表達。而用zebularine處理該細胞系，則不能誘導BRCA1的重新表達。CpG位點的甲基化可降低BRCA1啟動子對轉錄因子的易感性，這是嚴重甲基化的癌細胞中BRCA1下調機制之一。異染色質蛋白1(HP1)是一種強轉錄抑制因子，位于濃縮的沉默染色質區。HP1蛋白結合到染色質上一定程度是由特異性識別第9位賴氨酸(K9)被甲基化的H3組蛋白尾端的保守染色質結構域所介導的。這種結合是不穩定的，在有絲分裂過程中，可以被H3的第10位絲氨酸(S10)磷酸化伴隨第14位賴氨酸(K14)乙酰化所逆轉。這些組蛋白修飾也可根據幾種受MAP激酶和NFkappa－B通路調節的誘導型啟動子的活性觀察到。這些修飾也可通過核受體對轉錄活性起作用。

組蛋白的乙酰化修飾

因核小體組蛋白乙酰化和去乙酰化影響染色質的結構及形態變化并直接參與基因表達的調節，且該修飾是可逆的，這為研究腫瘤的藥物治療提供了平臺。目前與組蛋白異常去乙酰化修飾調節相關的抗腫瘤藥物研發集中在HDACs抑制劑上。這類調節組蛋白異常去乙酰化的HDACs抑制劑在體外實驗中能選擇性的阻滯細胞周期、促進細胞分化、誘導細胞調亡、抑制血管生成等，同時對正常的細胞表現出相對較小的毒副作用，但這種選擇性的作用機制目前尚不清楚。目前已經確認的HDACs抑制劑分為兩類:天然化合物及其衍生物、從化合物庫中篩選得到的藥物。

天然化合物及其衍生物包含有:TrichostatinA(TSA)、Depudecin、CHAP31、TrapoxinA、TrapoxinB、Apicidin、Butyrates、Valproicacids、Pyroxamide等，其中Butyrates，Valproicacids屬于短鏈脂肪酸類，Tri-chostatinA、Pyroxamide等屬于異羥肟酸類，Depude-cin、Apicidin、TrapoxinA、TrapoxinB等屬于環狀四肽類。從化合物庫中篩選得到的藥物主要有SAHA及MS－275，SAHA屬于異羥肟酸類，MS－275屬于苯甲酰胺類。有研究報道，HDACs抑制劑TSA與DNMT抑制劑decitabine能協同逆轉某些高甲基化的腫瘤抑制基因，使其重新表達;DNMT抑制劑能增強HDACs抑制劑所誘導的對腫瘤細胞的促凋亡作用。

染色體重塑

染色質重塑是基因表達調控過程中一個非常重要的環節。染色質重塑主要包括2種類型:一種是依賴ATP的物理修飾，另一種是依賴共價結合反應的化學修飾。依賴ATP的物理修飾主要是利用ATP水解釋放的能量，使DNA超螺旋旋矩和旋相發生變化，使轉錄因子更易接近并結合核小體DNA，從而調控基因的轉錄過程。依賴ATP的染色質重塑活性導致超螺旋扭轉，引起核小體重塑。依賴ATP的染色質重塑復合體都含有一個具有DNA激活的ATP酶活性部位，即ATP酶亞基，其核心功能是水解ATP并利用ATP水解釋放的能量去減弱核小體中DNA－組蛋白的結合力。

由于核小體發生了上述重塑，使得各種染色質重塑ATP酶聚集到特異DNA位點如啟動子上，與DNA結合蛋白如轉錄因子發生直接相互作用，激活基因轉錄過程。此外，在核心組蛋白氨基末端，組蛋白乙酰化通常和基因表達活化有關，而組蛋白脫乙酰化，在基因抑制中發揮作用。越來越多的研究表明，依賴ATP的染色質重塑復合體和腫瘤的形成發展有關，因此，對染色質重塑復合體及其作用機制的研究對揭示基因轉錄的調控、基因表達的抑制、DNA重組、復制和損傷修復以及腫瘤等一些疾病的發生發展有極為重要的意義。

生物芯片技術在腫瘤研究中的應用

高通量、基因組尺度的表達譜技術的發展可使研究者對腫瘤基因組的全貌進行透視。特別是高密度微陣列和基于測序的策略已經廣泛用于確證腫瘤的遺傳(如基因劑量，等位狀態，和基因序列突變)和表觀遺傳(如DNA甲基化，組蛋白修飾和microR-NA)異常。盡管這些一維表達譜技術的應用對于癌基因的發現有所幫助，但受低頻率事件影響的基因常被忽略。而多維平行分析的整合手段能夠證實通常受多種機制干擾，但在低頻率時受單一機制和組分影響的基因和通路。利用平行整合的多維手段研究腫瘤基因組，能夠對驅動腫瘤細胞的關鍵基因和通路有更深入的了解。

生物芯片(bio－chip)是近年來發展起來的一種高通量分析工具，在各種組學，如轉錄組學、代謝組學以及表型組學研究中發揮著重要的作用。生物芯片的廣泛應用也促成了一些新的學科如系統生物學的出現，為腫瘤生物學研究帶來了新的希望。例如目前應用較廣泛的一種生物芯片—DNA芯片，可用于基因診斷、基因表達分析、新基因發現及各種病原體的診斷等。由于生物芯片技術可以對DNA，RNA和蛋白質進行高通量分析，為腫瘤的分子生物學研究提供了一個良好的工具。

1突變和多態性檢測

腫瘤細胞的基因突變和多態性是腫瘤分子生物學的重要特征之一，以往研究突變和多態性多采用PCR－SSCP，手工或自動測序、異源雙鏈分析等方法，所有這些方法都無法進行大規模和自動化的分析，而DNA芯片技術可克服這些不足。

Hacia等(1996)用寡核苷酸芯片檢測乳腺癌基因BRCAI第11個外顯子(3．45kb)內所有可能的雜合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失等，并據此確定發病風險。在分析的15個病例中，14例為陽性，而20例對照均未出現假陽性，同時檢出8個單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)。盡管BRCAI基因可在22個編碼外顯子內發生突變，但是他們僅有5592個堿基組成，因此，有可能制造一個合適的芯片來檢測出所有可能發生的突變。單核苷酸多態性(SNPs)廣泛存在于各種生物基因組中，根據其在基因中的位置，可將SNPs分為外顯子SNPs(eSNPs)，內含子SNPs(iSNPs)，和啟動子SNPs(pSNPs)。在編碼區域(cSNPs)和調節區域(rSNPs)的SNPs對基因功能最可能有影響。根據但核苷酸替代對功能影響的表現，可分為未知功能SNPs，候選SNPs和蛋白質SNPs。現在許多生物信息學資源和分析工具已經開發出來用于SNPs研究，例如:FlySNPWebsite，JSNPdatabase，SNPseek，SNPbrowserSoftware，SNPsFinder，GeneSNPsdatabase，SIMP，MouseSNPs，SeattleSNPs，ForensicSNPInformation，SNPselector和ssSNPer等。

DNA芯片技術用于基因組研究可創建第三代遺傳圖。Wang等用芯片技術鑒定出3241個單核苷酸多態性(SNPs)，并構建了2227個SNPs的遺傳連鎖圖譜。個體SNPs基因型可為評價疾病易感性和治療優化選擇的基礎。在人類基因組中大約1kbp出現一個SNPs，若能將所有SNPs信息裝入DNA芯片中，則可檢測腫瘤患者與正常人以及不同腫瘤患者遺傳背景的差異，為腫瘤的發病機理提供遺傳學依據。

2基因診斷與腫瘤基因表達模式

將正常人基因組DNA和腫瘤病人基因組DNA與DNA芯片上的微陣列進行雜交，可分別得到標準圖譜和腫瘤的病變圖譜。通過兩種圖譜的比較分析，可以得到腫瘤的DNA信息，突變、缺失等異常發生在何部位?屬于什么樣的異常?得出正確的判斷后就可針對病變的靶序列設計基因藥物或基因疫苗，改變靶序列的表達情況，達到治療的目的。表達譜芯片以其大規模、高通量和并行處理的優點，為研究腫瘤發展中的基因開關及表達程度提供了強有力的工具，并可隨時獲得腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關基因的表達模式，從而使腫瘤的分子分型成為可能。

利用基因芯片獲取基因表達數據，采用eQTL作圖方法篩選cis－或trans－轉錄調節因子，對于了解腫瘤生長相關基因的表達調控方式，構建基因調控網絡以及認識腫瘤發生機制都十分重要。

3基因組分析及發現新基因

Welford等應用代表性差異分析結合微陣列雜交檢測了兩例不同生物學活性的Ewing’s肉瘤組織，一例為進展和轉移較快，另一例局限且治療效果良好。兩類腫瘤組織的mRNA經反轉錄成cDNA后首先進行RDA，RDA后的產物用“鳥槍法”克隆入質粒載體擴增后高密度排列到玻片上制成芯片。RDA方法可提供差異表達基因的濃聚庫，與cDNA芯片聯合則可以同時、快速、可重復地篩查上萬種DNA分子，從而獲得差異表達基因庫。

Yang等應用抑制性消減雜交結合DNA芯片技術對ER陽性和ER陰性的乳腺癌細胞系基因差異表達進行了研究。經過序列分析發現4個克隆分別為細胞發育因子19(cytokeratin)，GA－TA－3，CD24和谷胱甘肽－S－轉移酶u－3，另外4個克隆與兩個基因的EST序列一致，其余2個克隆為新基因序列。國內上海血液病研究所應用DDPCR和DNA芯片技術研究全反式維甲酸對急性早幼粒白血病細胞株NB4作用前后基因表達譜的變化，發現169個基因上調或下調，其中8個是未知的新基因。從上述研究中可以看出DNA芯片技術分析基因在不同時空表達及發現新基因方面是一個非常有效的技術。

4生物大分子相互作用研究

蛋白質芯片的作用原理同酶聯免疫吸附測定(ELISA)。蛋白質芯片不僅可以檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用，而且還可以測定蛋白質與DNA，RNA，配體和其他小分子化合物之間的相互作用，在腫瘤和其他疾病中可用于藥物靶向的研究與新藥的研制，同時也可用于自身免疫性疾病的診斷。德國學者Leuking等用人胎腦cDNA文庫hExl中的92個表達克隆產物及4例對照標木制成的蛋白質芯片與單克隆抗體RCS－His孵育，檢測RCS－His6標記融合蛋白在每一克隆的表達。在92個hEXI表達克隆中有54個克隆的插入序列與GenBank登記的人類基因序列一致。Leuking等人仍用上述蛋白質芯片分別與人類三磷酸甘油醛脫氫酶(APDH)、熱休克蛋白90a的羧基端片段(HSP90a)和a－微管蛋白相應的單克隆抗體反應，以觀察單克隆抗體的特異性。蛋白質芯片可用于檢測已知抗體的特異性;另一方面根據抗體的交叉反應可以發現蛋白質相互作用的新途徑，特別適用于配體—受體及藥物作用機制的研究。

MacBealh等根據DNA微陣列原理，設計出了蛋白質微陣列(Proteinmicroarray)。與微陣列上樣品共孵育的蛋白質、酶作用的底物或小分子物質分別標有不同顏色的熒光基團，反應結束后采用通用的激光共聚焦掃描分析系統進行檢測，這不但提高了檢測的信息量:而且整個操作過程簡單易行。

腫瘤生物信息學研究方法

21世紀是生命科學的時代，生物信息學為生命科學的發展提供了便利和強有力的技術支持，具有重要的基礎研究價值。在應用研究方面，生物信息學在尋找人類疾病基因、預測基因和蛋白質表達的結構及功能和合理設計藥物等方面都起著至關重要的作用。過去幾十年，已經收集了大量有關癌癥分子和遺傳特征的信息。這些知識主要是基于還原論途徑，同時癌癥也被認為是“系統生物學疾病”。而復雜的生理過程不能通過簡單地了解各個部分的功能來認識。不能用現有的處理復雜問題的方法將所有知識進行整合，還必須考慮生物網絡:復雜問題的了解不考慮基因組之外的影響是不可能的。系統生物學將實驗的多變量數據與數學和計算機方法相結合，模擬生物系統進行假設檢驗，或從高通量數據來說明未知的東西。代謝組學可建立基因型和表型之間的連接，提供信息以對病理機制和代謝表型進行全面了解，為新的靶向藥物提供篩選工具。人們越來越清楚，所有復雜性狀都受控于多個基因，涉及分子相互作用網絡。IntNetDB正是基于類似的思想為研究基因相互作用而編制的數據挖掘工具。徐興興等通過IntNetDB找到基因PPP4R1的伙伴基因，應用CFinder工具找其社團基因，Chilibot在線工具分析社團基因與腫瘤的關系，繼而推測PPP4R1與胃癌的聯系。

1986年，華盛頓大學的Swanson教授提出了基于文獻的知識發現(Literature－basedDiscovery)的理論，指出非相關的生物文獻中可能隱含著大量的不為人知的科學知識(UndiscoveredPublicKnowl-edge，UPK)。目前，對生物醫學文獻的挖掘研究已成為生物醫學領域的研究熱點，應用到生物醫學研究的各個領域。通過文獻挖掘的方法以及生物信息學的分析可以發現蘊藏在文獻中潛在的知識。

李鐵求等(2009)通過FACTA工具從PubMed找出前列腺癌的相關基因進行分類，利用GATHER、PANTHER、STRING和ToppGene等在線工具對雄激素非依賴型前列腺癌特異表達基因進行生物信息學分析。篩選雄激素非依賴型前列腺癌特異基因128個，這些特異表達基因在細胞信號轉導、凋亡、腫瘤生成、細胞粘附、細胞增殖和分化等生物學過程起著重要作用。通過生物信息學對雄激素非依賴型前列腺癌特異表達基因的挖掘發現，MMP9、EGFR、MMP2、ADM、MIF、IGFBP3、IL2、MET、BAD、RHOA、SPP1、EP300、SMAD3、RAF1、PTK2、TGFB2等基因在雄激素依賴型轉變成非依賴型前列腺癌中可能起著重要作用。建立獨立的腫瘤相關的生物信息數據庫可以更好地為腫瘤的研究提供支持。如美國癌癥研究院(NCI)的小鼠腫瘤生物學數據庫(MTB，tumor．informatics．jax．org，強生研究院的小鼠數據庫和人類腫瘤聯盟的小鼠腫瘤模型數據庫，法國的國際癌癥研究院(IARC，www．iarc．fr/)的人類腫瘤和細胞p53基因突變數據庫，斯坦福大學的SMD(genome－www5．stanford．edu/)數據庫、耶魯大學的YMD數據庫和歐洲生物信息學研究院(EBI)的ArrayExpress數據庫等。利用EST數據庫對全基因組進行腫瘤差異表達基因的生物信息學篩選，是一種經濟快速有效的篩選方法。對腫瘤標志物的鑒定具有重要意義，為腫瘤差異表達基因的篩選策略提供了新的思路。

利用gPET配對末端策略，EdisonT．L等將作圖精度提高到100bp，MCF7乳腺癌細胞系基因組結構圖對癌基因組所有可能的遺傳重排提供了詳細綜合的注釋。為了進一步分析，EdisonT．L等將MCF－7全長680，000bp的cDNA克隆定位到同一細胞系的gPET重排圖譜上。重疊被認為是導致融合轉錄的部分有效重排。該研究組已經證實了近450個可產生可變轉錄的假想重排，約75個達到了多標簽水平。

在基因組水平對于腫瘤相關基因進行掃描和篩選，可以很快地找到腫瘤易感基因和發病基因，同時依據生物信息學手段，可以很快地設計出針對這些靶標的治療藥物。因此，隨著生物信息學在腫瘤研究方面的應用，人類將逐漸認識腫瘤發生的分子機制，為抗腫瘤藥物的設計和研究提供參考，使人類將會有更好的手段去預防和治療腫瘤。

展望

腫瘤表觀基因組學是近年來發展較快的領域，特別是對于腫瘤的治療，新的靶向藥物設計和研究有重要的作用，發生在染色體上的表觀遺傳修飾與腫瘤的發生有密切關系，因此，對DNA、組蛋白的甲基化和乙酰化修飾以及染色質重塑復合體的作用機制的研究對揭示基因轉錄的調控、基因表達的抑制、DNA重組、復制和損傷修復以及腫瘤等一些疾病的發生發展有極為重要的意義，為制定腫瘤的治療策略和開發新的抗腫瘤藥物提供可靠的科學依據。

蛋白質在腫瘤的發生、浸潤和轉移等方面有很重要作用，而后基因組時代對蛋白質生物功能的研究將對基因組中功能基因的認識提供很有價值的信息，因此蛋白質功能方面的研究必將成為生命科學研究的重點。生物芯片技術已被證明可以進行基因診斷、基因表達研究、發現新基因、蛋白質與蛋白質以及蛋白質與其他生物大分子的相互作用等眾多領域的研究，具有廣闊的應用前景。但是生物芯片是眾多學科許多技術相互融合、相互滲透的結果，對生物芯片數據信息的處理還需要有功能完善的生物信息學軟件的輔助，在某些技術方面仍不甚完善，要成為實驗室或臨床可以普遍采用的技術仍有一些關鍵問題待解決。