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1材料與方法
1.1藥品、試劑和實驗動物何首烏飲方劑購自承德市肛腸醫院；D-半乳糖購于北京化學試劑公司；PCNA購自中杉金橋生物試劑公司；TUNEL試劑盒購自Roche生物試劑公司。清潔級8周齡雄性SD大鼠，體重180～220g，購自河北醫科大學實驗動物學部，動物合格證號：605106。
1.2何首烏飲藥物溶液的制備何首烏飲方劑組成:何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓按質量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，水浸泡1h，然后水煎2次，30min/次，過濾后濃縮至含生藥分別為0.75，1.5，3.0g·ml-1（分別作為低、中、高劑量藥液）。4℃保存，給藥前復溫至25～30℃。
1.3造模及實驗分組50只SD大鼠隨機分成陰性對照組、模型組、何首烏飲低、中、高劑量組（10，20，40g·kg-1·d-1），每組10只。陰性對照組腹腔注射等體積生理鹽水，其余4組大鼠腹腔注射D-半乳糖300mg·kg-1(用生理鹽水配制成6%的溶液)，連續60d，制備亞急性衰老大鼠模型［2］。給藥組在造模第1日起同時每天一次灌胃何首烏飲，連續60d；陰性對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。
1.4檢測方法
1.4.1采用免疫組織化學S-P法按照免疫組化常規步驟操作。石蠟切片的抗原修復采用pH6.0的檸檬酸抗原修復液，加熱至沸騰后5min緩慢冷卻；PCNA(抗體稀釋比1∶200)4℃過夜。以PBS替代一抗作為陰性對照。
1.4.2原位末端標記法(TUNEL染色法)將切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，切片常規脫蠟至水，各步驟按TUNEL試劑盒操作，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。以不含末端脫氧核苷酸轉移酶的液體代替TUNEL混合液作陰性對照。
1.4.3結果判定PCNA及TUNEL染色標本細胞胞核染成棕黃色粗顆粒為陽性反應細胞。在顯微鏡(400×)下，每張切片上隨機選取10個視野，計數陽性細胞，每組計數3只動物，每個標本計數3張切片，計算每個視野的平均陽性細胞數。
1.4.4數據處理Excel建立數據庫，SPSS13.0軟件分析，單因素方差分析比較組間差異。
2結果
2.1免疫組化染色結果各組切片均可見PCNA染色，免疫陽性產物位于細胞核，通常呈棕黃色顆粒狀，小部分呈彌散狀。免疫陽性細胞主要分布于腎小管，腎小球有少量表達。模型組大鼠腎臟PCNA陽性細胞數低于陰性對照組大鼠，何首烏飲各劑量組PCNA陽性細胞數高于模型組，差異均有統計學意義。見表1。
2.2TUNEL染色結果TUNEL陽性細胞主要表達在腎小管上皮細胞，腎小球僅有少量表達。模型組大鼠中凋亡細胞成簇存在，而在用藥組散在分布。模型組大鼠腎臟TUNEL陽性細胞數高于陰性對照組，何首烏飲各劑量組TUNEL陽性細胞數均低于模型組，差異均有統計學意義。見表1。
表1各組大鼠腎臟PCNA和TUNEL結果比較（略）
與陰性對照組比較，▼P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；n=9
2.3PCNA和TUNEL的相互關系經相關分析PCNA和TUNEL具有負相關關系（r=-0.912，P=0.000）。
3討論
近年來延緩衰老以及老年病的預防已成為國內外研究的焦點，尋找有效的抗衰老藥物是衰老研究中的一個重要方面。由于化學藥物的廣泛使用及其毒副作用，研究的方向已矚目于傳統中藥。何首烏飲由何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓組成。何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝能填精補髓、烏發延年，淫羊藿補腎壯陽以強筋骨，丹參活血化淤以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。近年研究發現何首烏、淫羊藿、丹參、肉蓯蓉等具有改善脂肪代謝、抗衰老等作用［3］。
增殖細胞核抗原(PCNA)是一種只出現在增殖狀態細胞核中的蛋白質，其表達合成與細胞增殖周期相關，由G1期開始，于S期達到高峰，至G2期及M期則明顯減少［4］。此外它是DNA聚合酶δ的輔因子/輔蛋白，在細胞分裂過程中為DNA合成所必需，協調DNA前導鏈和后隨鏈的合成［5］，因此可以作為一項評估細胞增殖狀態的指標［6］。于會民等［7］研究發現生物素通過提高增殖細胞核抗原的轉錄水平，促進其翻譯和合成水平，促進脾臟細胞DNA的合成，從而促進其細胞增殖與分化。陳志宏等［8］研究發現用天年飲灌胃后，睪丸PCNA陽性生精細胞明顯增多。本研究顯示，PCNA蛋白在何首烏飲各劑量組表達均高于模型組，其中何首烏飲高劑量組的表達最高。提示何首烏飲可以提高細胞PCNA蛋白的表達，促進細胞增殖的作用。
細胞凋亡是細胞受到生理或病理刺激后在基因控制和酶促反應下按一定程序進行的細胞主動死亡過程［9］。可調節多種細胞的數目，在胚胎發育、器官保持自身動態平衡過程中，發揮重要作用。本實驗TUNEL法結果顯示模型組大鼠中凋亡細胞成簇存在，而在用藥組只見散在的凋亡細胞。何首烏飲各劑量組TUNEL陽性細胞數均低于模型組(P<0.05)。龐曉靜等［10］報道天年飲灌胃后，垂體前葉凋亡細胞明顯減少，陽性細胞總數與模型組、對照組比較均有顯著差異（P<0.01），與本實驗結果一致。
凋亡與增殖是生物體內重要的生命現象兩者之間存在著重要的關聯。兩者都是一系列基因產物協調表達的結果，其動態平衡對于保持機體的穩定起著重要的作用，其動態失調和機體的衰老過程及疾病的發生都有著密切的關系。何首烏飲一方面可明顯提高衰老大鼠腎臟PCNA陽性細胞的表達，起到了促進細胞的增殖的作用另一方面又可以抑制細胞的凋亡，因此何首烏飲可部分保護衰老大鼠的腎臟，具有一定延緩衰老的作用。但是衰老與增殖凋亡的關系極其復雜亦與各種細胞信號傳導通路關系密切，其機制有待進一步研究。