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杜仲EucommiaulmoidesOliv.為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬落葉喬木,為我國特產。杜仲皮是我國傳統的中藥材,具有補肝腎、強筋骨、安胎、降血壓等功效。杜仲傳統以皮入藥,然而杜仲皮的生產年限較長,一般20年左右才能剝皮,藥源遠遠不能滿足需要。近年來有關學者在杜仲以葉代皮方面做了不少研究[1,2],發現杜仲葉與杜仲皮藥用成分的含量基本一致[2~4],且藥效相當,甚至有一些藥用成分,如綠原酸,其葉中的含量高于皮中含量的5倍[5]。因此,杜仲葉不僅可以作為杜仲的新藥源,而且可以作為保健品的新原料。綠原酸是杜仲葉中的重要成分[1,5],具有利膽、抗菌、抗病毒、降壓、增高白血球及興奮中樞神經系統等多種藥理作用,是保健、醫藥等工業的重要原料[5~7]。杜仲葉中的綠原酸的含量常作為評價杜仲葉品質的重要依據,而杜仲葉中綠原酸的產生與杜仲葉細胞發育有密切關系。本實驗在對杜仲葉結構發育研究的基礎上,用HPLC方法測定了杜仲葉中綠原酸含量[8~10],探索了杜仲葉中綠原酸含量與杜仲葉結構發育之間的關系以及杜仲葉中綠原酸含量變化的規律,為杜仲葉的綜合開發利用及最佳采葉時期的確定提供科學依據。
1器材
1.1藥材本實驗所用材料均取自河南師范大學生命科學學院生物園地(東經113°86''''、北緯35°31'''')。
1.2儀器和試藥儀器為美國Waters600高效液相色譜儀。Sep-pakC18柱,510泵,490可編程序紫外檢測器,680梯度裝置。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
2方法
2.1杜仲葉結構的觀察從2006²04開始,每月取樣1次,直到落葉前的11月。用于測定綠原酸含量的杜仲葉采摘后在室內自然風干,粉碎備用。用于切片的材料,取后立即用3%戊二醛固定液固定并保存,常規石蠟切片制片法制片,番紅-固綠染色,Olympus顯微鏡觀察組織結構,常規顯微測量。
2.2綠原酸的含量測定采用高效液相色譜法。
2.2.1色譜條件流動相為乙腈(CH3CN)∶2%乙酸(HAC)水溶液(25∶75);流速為1.0ml/min;檢測器波長分別為326nm,254nm;進樣量1μl。
2.2.2綠原酸的測定精確稱取粉碎、過100目篩的杜仲葉樣品2g,加入150ml80%的甲醇水溶液,超聲波振蕩30min,抽濾,其濾液置于25ml容量瓶中,80%的甲醇水溶液定容。取出50ml放入旋轉蒸發器中蒸除甲醇,蒸至10~20ml轉至分液漏斗,以2N的鹽酸酸化,加醋酸乙酯20ml靜置分層,下層水相重復用醋酸乙酯萃取3次,合并醋酸乙酯,加無水Na2SO4脫水,濾除Na2SO4,濾液濃縮至干,然后加2ml甲醇溶液溶解,取0.2ml于活化的Sep-pakC18柱頂端,用80%的甲醇洗脫,收集前2ml洗脫液作樣品測定。
3結果
3.1杜仲葉生長發育中形態結構的變化杜仲葉橫切面觀察,杜仲葉片結構屬于典型的中生性雙子葉植物葉結構。葉片由表皮、葉肉和葉脈三部分組成。上表皮為一層細胞,排列緊密,長方形,外被角質層;上表皮下面是柵欄組織,柵欄組織也由一層細胞組成,細胞呈長圓柱形;柵欄組織下方是由3~4層細胞組成的海綿組織,海綿組織細胞內含有膠細胞,即海綿組織內含有膠絲。海綿組織細胞下面是下表皮,下表皮也由一層扁平細胞組成,下表皮分布有較多氣孔。網狀葉脈,其中主脈維管束外韌型,形成層明顯。
杜仲葉的結構在生長發育過程中隨著月份變化也在不斷變化(見表1)。4月份葉片厚度最小,角質層也最薄,結構分化不明顯,柵欄組織,海綿組織沒有分開,此后隨著時間推移,葉片厚度增加,柵欄組織厚度、海綿組織厚度以及角質層的厚度都逐漸增加,到7月份各項指標都達到最大,柵欄組織,海綿組織分化最明顯,而后直到11月份葉子落下都保持穩定。柵欄組織與海綿組織厚度的比值也是在4月份最小,5月、6月份逐漸增大,7月份達到最大,以后趨于穩定。表皮細胞所占葉片厚度的比例在4月份最大,以后逐漸變小,7月份以后趨于穩定。
表1不同生長時期杜仲葉解剖結構的特征(略)
3.2不同生長發育時期杜仲葉中綠原酸含量的變化葉片結構的變化與化學成分的變化有著密切的關系。杜仲葉中的綠原酸的含量隨葉子生長而變化,在4~6月份綠原酸含量隨葉片的生長發育而增加,綠原酸在葉中含量的最大值出現在植株生長最旺盛的6月份,葉片中綠原酸含量達到最高為1.153%,比年平均含量高出33.0%,然后又隨著葉片生長進入衰老階段,綠原酸含量逐漸下降,到葉落時達到最低為0.483%,比年平均含量低45.8%。結果見表2。
表24~11月份杜仲葉中綠原酸的含量(略)
4討論
杜仲是我國特有的經濟樹種,在我國有大面積種植,每年杜仲葉產量約400萬t。本研究結果顯示,杜仲葉中含有豐富的杜仲皮指標成分綠原酸,可以作為杜仲的新藥源和保健品的新原料。杜仲葉片結構的發育與綠原酸含量的變化有著密切的關系。葉片發育早期,隨著柵欄薄壁組織、海綿薄壁組織等葉肉細胞的分化發育,杜仲葉片中綠原酸含量的不斷增加。6月葉片組織結構發育成熟時葉片中綠原酸的含量達到最高。但此時采集葉片將嚴重影響杜仲樹生長。之后,隨著葉片的衰老,葉片中綠原酸的含量不斷降低,7~8月綠原酸降低較慢,9月之后綠原酸迅速降低,至落葉前(11月)葉片中綠原酸的含量最低。綜合分析葉片生物量和綠原酸的含量,7~8月份采集杜仲葉較合適。