多種雌激素殘留的質(zhì)譜分析范文

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《分析測(cè)試技術(shù)與儀器雜志》2016年第2期

摘要:

建立了同時(shí)測(cè)定7種雌激素殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法．在最優(yōu)條件下，待測(cè)物呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0．9957，檢測(cè)限介于0．5000～50．00ng/mL范圍．魚(yú)肉組織經(jīng)C18小柱凈化濃縮，4．0mL乙腈－水(體積比5∶95，%)淋洗，2．0mL乙腈－水(體積比95∶5，%)洗脫．三類魚(yú)肉樣品中(鮦魚(yú)、龍膽魚(yú)、多寶魚(yú))均檢出雙酚A和己二烯雌酚，部分樣品中檢出雌二醇和雌酮，加標(biāo)回收率為85．70%～120．9%．方法快速、準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中雌激素多殘留的高效測(cè)定．

關(guān)鍵詞:

雌激素;固相萃取;液相色譜;串聯(lián)質(zhì)譜;水產(chǎn)品

雌激素是一類常見(jiàn)的內(nèi)分泌干擾物，會(huì)擾亂機(jī)體內(nèi)分泌物的正常生成、轉(zhuǎn)化、代謝和結(jié)合，造成生物體免疫、生殖功能異常［1－2］．近年來(lái)，避孕藥和畜牧養(yǎng)殖用藥使用量激增，在湖泊、河流、污水中均存在雌激素富集的現(xiàn)象，導(dǎo)致魚(yú)類出現(xiàn)嚴(yán)重性畸形［3］．對(duì)人類而言，雌激素通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移，進(jìn)入人體可誘發(fā)兒童性早熟，對(duì)成人生育功能也有影響，尤其對(duì)女性影響最為明顯，易造成流產(chǎn)、嬰兒出生缺陷等問(wèn)題，甚至誘發(fā)卵巢癌、乳腺癌等疾病［4－5］．因此，雌激素對(duì)環(huán)境、生態(tài)和人類的影響備受關(guān)注，有必要建立靈敏、科學(xué)的方法分析雌激素．目前，雌激素多殘留檢測(cè)分析方法已有綜述［6－7］，主要包括氣相色譜［8］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［9－10］、液相色譜法［11－12］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用［13－16］等．其中，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－MS/MS)以選擇性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，應(yīng)用最廣．四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF－MS)靈敏、分辨率高、特異性強(qiáng)，基于碰撞誘導(dǎo)解析和二級(jí)質(zhì)譜功能，提供化合物的結(jié)構(gòu)斷裂原理，在雌激素等藥物殘留檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景．

1試驗(yàn)部分

1．1儀器與試劑

1200系列液相色譜－6520型四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent，USA);Milli－Q超純水系統(tǒng)(Milipore，USA);7018－00固相萃取裝置(JTBaker公司)．雌三醇(E3)、雙酚A(BPA)、雌二醇(E2)、2，4－二氯苯酚(2，4－dcp)、己二烯雌酚(DE)購(gòu)自Sigma－aldrich公司，炔雌醇(EE)、雌酮(E1)購(gòu)自德國(guó)DrEhrenstorferGmbh公司．乙腈為色譜純(Sigma－aldrich公司)，乙酸銨購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠，試驗(yàn)用水為超純水．所有試劑使用前過(guò)濾．

1．2溶液配制及工作曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，乙醇溶解，配制成1000μg/mL儲(chǔ)備液，4℃貯存．乙酸銨溶液:稱取0．77g乙酸銨，定容至1000mL，稀釋成5．0、1．0mmol/L溶液，用于后續(xù)試驗(yàn)．工作曲線繪制:混合標(biāo)準(zhǔn)母液用超純水逐級(jí)稀釋，獲得一系列混標(biāo)工作溶液．在最優(yōu)條件下測(cè)定，根據(jù)峰面積與相應(yīng)濃度的關(guān)系繪制工作曲線．

1．3液相色譜－質(zhì)譜條件

色譜柱AgilentZorbaxSB－C18(Φ5μm，4．6×150mm);流動(dòng)相為H2O(A)－乙腈(B)二元體系;梯度洗脫;流速0．4mL/min;進(jìn)樣量8μL;柱溫35℃．質(zhì)譜選擇ESI(－)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;干燥氣溫度350℃、流速10L/min;霧化氣壓力0．276MPa;毛細(xì)管電壓3500V;碎裂電壓140V;2GHz動(dòng)態(tài)拓展采集模式;m/z100－310．試驗(yàn)所用氣體為氮?dú)?純度＞99．9%)，碰撞氣為高純氮?dú)?純度＞99．999%)．

1．4樣品處理

樣品提取:鮦魚(yú)、龍膽魚(yú)、多寶魚(yú)購(gòu)自福州馬尾水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)．魚(yú)類去頭、鱗、骨及內(nèi)臟，取魚(yú)肉組織，液氮中研磨成魚(yú)粉．稱取0．50g魚(yú)粉，加入5．0mL乙腈，超聲提取10min，10000r/min下離心10min，取上清液．殘?jiān)儆?．0mL乙腈重復(fù)提取，合并兩次上清液．提取液用正己烷脫脂，每次用量3．0mL，重復(fù)操作二次，棄去正己烷，氮?dú)獯蹈桑?．0mLH2O溶解待用．固相萃取(SPE):BondElut－C18小柱(200mg/3mL，Agilent公司)用3．0mL甲醇活化、3．0mL水平衡，提取液過(guò)柱，4．0mL乙腈－水(體積比5∶95，%)淋洗、2．0mL乙腈－水(體積比95∶5，%)洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮，H2O定容至1．0mL，過(guò)濾后供HPLC－MS分析．

2結(jié)果與討論

2．1色譜流動(dòng)相選擇

選定ZorbaxSB－C18色譜柱(Φ5μm，150×4．6mm)，考察乙腈－水、乙腈－1．0mmol/L乙酸銨及乙腈－5．0mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果如圖1(a)所示．試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸銨濃度增大，雌激素峰面積總體呈下降趨勢(shì)．故采用乙腈－H2O為流動(dòng)相，此時(shí)色譜峰響應(yīng)高、分離效果理想．在分離復(fù)雜混合物時(shí)，梯度洗脫能提高分析效率、改善分離度．嘗試了多種梯度方案對(duì)混合物分離的影響．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)的梯度洗脫程序?yàn)?0～4．0min，維持65%B;4．0～4．1min，65%～97%B;4．1～8．0min，維持97%B;8．0～8．5min，97%～65%B，流速為0．4mL/min．在單次分析結(jié)束后，充分沖洗和平衡色譜柱．

2．2MS條件的優(yōu)化

7種雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示，其結(jié)構(gòu)中含有不同數(shù)量的羥基或氯原子，首選ESI(－)檢測(cè)．為保證母離子良好的傳輸效率，優(yōu)化了質(zhì)譜碎裂電壓的影響，如圖1(b)所示．當(dāng)碎裂電壓介于140～150V之間，大部分物質(zhì)的響應(yīng)值基本恒定，故選取碎裂電壓為140V．其他質(zhì)譜參數(shù)的選擇是為了改善噴霧效果和電離狀況，提高方法的靈敏度．經(jīng)優(yōu)化，確定干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min．最優(yōu)條件下，待測(cè)物在8min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，且形成很強(qiáng)的［M－H］－母離子峰和明顯的同位素峰(如圖3所示)．

2．3前處理方法探索

對(duì)比了兩種C18小柱的萃取效果．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ProElut－C18小柱對(duì)E3和BPA的回收率不理想(低于50%)．提取液經(jīng)BondElut－C18小柱過(guò)柱，采用5%、10%、20%的乙腈－水溶液淋洗．乙腈含量越高，淋洗液的洗脫能力越強(qiáng)．5%乙腈－水淋洗時(shí)，后續(xù)檢測(cè)雜質(zhì)稍多，但利用質(zhì)譜提取離子功能，目標(biāo)物測(cè)定不受影響且回收率較高．考察乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)在80%～100%的洗脫效果．當(dāng)乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于90%時(shí)，后續(xù)濃縮步驟耗時(shí)長(zhǎng)、回收率不高;乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%時(shí)的洗脫效果與100%乙腈接近，因此選擇95%乙腈將目標(biāo)物洗脫．優(yōu)化了洗脫液體積(1．0～3．0mL)，發(fā)現(xiàn)用量為2．0mL時(shí)，目標(biāo)物回收效果較好．因此，BondElut－C18小柱以4．0mL5%乙腈－水淋洗，2．0mL95%乙腈洗脫．相較于液液萃取，SPE法操作簡(jiǎn)便、節(jié)省有機(jī)溶劑．

2．4二級(jí)質(zhì)譜解析

利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)分析物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(如圖4所示)．E2、E3、EE和E14種組分具有相同母核，形成共同的碎片離子峰m/z145．0637(或143．0491)、183．0798，上述物質(zhì)的斷裂原理與文獻(xiàn)［17－18］相符．BPA苯環(huán)側(cè)鏈上兩個(gè)甲基空間位阻大，推測(cè)丟失—CH3、—C6H6O、—C3H4等自由基碎片．2，4－dcp對(duì)應(yīng)的碎片離子m/z124．9776、89．0034為連續(xù)丟失—Cl所得．DE是苯二烯類化合物，分別形成［M－H－CH3］－．、［M－H－C3H6］－．、［C6H5O］－．等碎片．后3種物質(zhì)的多級(jí)質(zhì)譜斷裂途徑鮮見(jiàn)報(bào)道(如圖5所示)．

2．5方法驗(yàn)證

精確配制7種雌激素的系列標(biāo)準(zhǔn)混合液，考察線性關(guān)系，以3倍信噪比為檢測(cè)限，結(jié)果如表1所列．方法的檢測(cè)限為0．5000～50．00ng/mL，相關(guān)系數(shù)介于0．9957～0．9999范圍內(nèi)．以200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)混合液(BPA40ng/mL，EE400ng/mL，其余組分為200ng/mL)進(jìn)行精密度試驗(yàn)，連續(xù)5天進(jìn)樣，日間RSD小于9．074%，表明方法穩(wěn)定且重現(xiàn)，適合于7種雌激素的定量分析．

2．6魚(yú)肉樣品分析

魚(yú)肉樣品中雌激素的計(jì)算公式為:Cx=Ci×V/m，其中，Ci為各化合物質(zhì)量濃度(由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，ng/mL)，V為樣品處理最后定容的溶液體積(mL)，m為魚(yú)粉質(zhì)量(g)．試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，雖經(jīng)SPE凈化，在質(zhì)譜總離子流圖中干擾峰仍較多．利用QTOF質(zhì)譜的提取離子功能結(jié)合保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)等信息，3種魚(yú)肉中均檢出BPA和DE，部分樣品檢出E2和E1殘留(如表2所列)．向龍膽魚(yú)樣品添加兩個(gè)不同質(zhì)量濃度的目標(biāo)物，每個(gè)水平測(cè)定3份樣，計(jì)算回收率(如表3所列)．由表3可得，目標(biāo)物回收率大于85．70%，RSD為0．8370%～3．568%，表明方法可靠，滿足分析檢測(cè)的要求．

3結(jié)論

建立了固相萃取－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定7種雌激素殘留的方法．結(jié)合Q－TOF－MS/MS定性精確、結(jié)構(gòu)信息豐富的特點(diǎn)，推測(cè)了部分雌激素的裂解途徑．此研究能為水產(chǎn)品中激素類藥物殘留的快速鑒定提供分析手段，也有助于了解雌激素殘留分布的規(guī)律，為保證食品安全提供方法借鑒．

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作者:盧巧梅 單位:福州大學(xué)食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室