色譜研究的最新動態范文

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《色譜雜志》2015年第十一期

色譜是復雜樣品分離分析的重要手段。當前復雜樣品的分析對分離科學提出了越來越高的要求，而發展新型高效分離材料、分離模式和高靈敏度的檢測方法是解決該問題的有效途徑之一。本文依據2015年6至8月AnalyticalChemistry新錄用和在線發表的有關論文，討論色譜在樣品前處理、固定相、手性拆分、分析檢測、蛋白質組學等方面的最新研究動態和進展。

1樣品前處理

樣品前處理是分析過程的關鍵環節，直接影響著分析結果的準確度和精密度。膜蛋白的疏水性強、溶解性差和豐度低，對它的分離分析是蛋白質組學中的一大難題。復旦大學的劉寶紅教授課題組［1］采用殼聚糖改性的介孔泡沫石墨烯（MGF－CS）作為納米反應器，從有機溶劑中高效富集疏水性膜蛋白并進行原位酶解。將該技術應用于實際樣品中膜蛋白的分析鑒定，采用二維液相色譜－質譜方法（2D－LC－MS）可鑒定931種膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法僅能鑒定73種膜蛋白。結果表明多功能的MGF－CS對蛋白質組學中膜蛋白的分析鑒定具有重要的應用價值。分子印跡技術是采用人工合成方法制備對目標分子有特異性識別材料的技術。目前針對有機小分子和金屬離子的印跡工作已取得了巨大進展。由于蛋白質體積大、結構復雜、易于變性，完整蛋白質模板分子難以獲得且價格昂貴，因此限制了蛋白質分子印跡材料的發展。中國科學院大連化學物理研究所張麗華研究員課題組［2］提出了一種蛋白質抗原決定基分子印跡磁性納米材料的制備新方法。抗原決定基印跡是以目標蛋白質上一段特異性多肽為模板分子進行印跡。由于模板肽段與目標蛋白質間存在極強的特異性，形成的印跡位點對模板肽段及目標蛋白質均具有特異性識別能力。首先在SiO2包覆的磁性Fe3O4納米粒子表面通過化學修飾引入亞氨基二乙酸（IDA）基團。利用IDA與Ni2＋的螯合作用，將Ni2＋固載在基質材料（Fe3O4＠SiO2＠IDA＠Ni2＋）表面；然后加入末端修飾有組氨酸標簽的模板肽段溶液，使模板通過與Ni2＋的螯合作用固載于基質表面；隨后按一定的質量比在上述固載模板的基質材料中加入功能單體多巴胺，在弱堿性條件下進行自聚合形成分子印跡層，制備出核－殼型復合納米粒子，可通過單體的用量控制殼層厚度；聚合完成后，反復用200mmol／LEDTA－2Na水溶液清洗聚合物材料，使其中的模板分子洗脫出來，進而得到抗原決定基分子印跡材料。該表面分子印跡納米材料對目標蛋白質具有很好的選擇性識別作用。該制備方法不僅解決了蛋白質分子印跡中蛋白質難以獲得、價格昂貴的問題，同時多肽模板構象穩定，增加了印跡位點識別的特異性。通過金屬螯合作用將模板多肽固載于基質表面，大大提高了模板的利用率。該方法對制備不同目標蛋白質抗原決定基印跡材料具有通用性和普適性。

金屬有機骨架化合物（metal－organicframe－works，MOFs）因具有比表面積大、結構多樣性、孔道尺寸可調、骨架可修飾、熱穩定性和化學穩定性良好等優點而廣泛應用于分離分析等領域。西班牙BalearicIslands大學的Palomino課題組［3］利用注射器設計了一種針管式自動磁性MOFs分散固相微萃取裝置。首先將10mg磁性MOFs材料Fe3O4＠MIL－100（Cr）和一個磁子置于5mL針管內。該針管類似于一個雙向的注射泵。以高流速將樣品溶液從針頭處加入針管內，使MOFs材料完全分散于樣品溶液中。在攪拌過程中選擇性吸附樣品的磁性MOFs納米顆粒逐漸吸附于磁子上。可以通過控制磁子的磁性釋放和回收磁性MOFs納米粒子。待吸附完全，推動注射器的活塞桿將溶液擠出。再按上述方法用水多次充分洗滌MOFs納米吸附劑，最后用洗脫劑洗脫樣品后進行檢測。該裝置設計巧妙，簡單易行，便于與檢測器或分離裝置連接。將其應用于各種水樣和魚樣中孔雀石綠的分析檢測，檢出限達到0.012mg／L，線性范圍為0.04～2mg／L。澳大利亞BahauddinZakariya大學的Najiam－ul－Haq課題組［4］構建了一種磁性氧化鑭和氧化釤核－殼納米粒子（Fe3O4＠SiO2－La2O3和Fe3O4＠SiO2－Sm2O3），成功地用于各種酪蛋白、脫脂牛奶、蛋黃、人血清和Hela細胞提取物中磷酸化肽和磷酸化蛋白質的富集。該吸附材料幾乎沒有不可逆吸附，在8500倍的非磷酸化蛋白質牛血清白蛋白（BSA）背景溶液中對β－酪蛋白仍表現出了非常高的選擇性，靈敏度可達到attomole（10－18mol）級，重現性好，在磷酸化蛋白質組學中具有很好的應用前景。

2固定相

多孔整體材料作為一種新型分離介質，由于其具有制備簡便、通透性好、性能穩定和易于修飾等特點而被譽為第四代色譜分離介質。鄒漢法課題組［5］發展了一種基于光引發巰基－丙烯酸酯點擊聚合反應的新方法，并成功制備了具有高分離性能的有機－硅膠雜化整體柱。與巰基－烯和巰基－甲基丙烯酸酯點擊聚合反應相似，光引發的巰基－丙烯酸酯點擊聚合反應不僅反應效率較高，速度快（通常10min內即可完成），而且反應條件非常溫和。所制備的有機－硅膠雜化整體柱的微觀結構非常均一、規整，并且具有較高的機械強度、熱穩定性和化學穩定性。將其應用于毛細管液相色譜，柱效高達73500N／m，實現了對苯系物、苯酚類、苯胺類等小分子化合物的高效分離。此外，所制備的整體柱對16種多環芳烴PAHs混合標準物（EPA610）和蛋白質酶解液等一些復雜的環境和生物樣品也具有較好的分離能力。表明采用巰基－丙烯酸酯點擊聚合反應可以有效制備出具有高效分離能力的新型毛細管有機－硅膠雜化整體柱。加拿大卡爾加里大學的Thurbide小組［6］將316不銹鋼粉末（粒徑44～149μm）填充于316不銹鋼毛細管柱內作為支持體，將水泵入色譜柱中，建立了以水為固定相，CO2為流動相，與火焰離子化檢測器聯用的超臨界流體色譜分離體系（SFC－FID）。該體系可在一定的溫度和壓力范圍內進行操作。樣品保留時間的重現性良好（RSD2.6％）。與不銹鋼毛細管直接用水涂層作為固定相相比，這種用不銹鋼粉末填充柱的方法不僅可以保持良好的色譜峰形和高柱效，還可使分離速度提高10倍，保留因子提高約8倍，樣品量提高20倍。

3手性拆分

德國萊比錫城大學的Belder小組［7］將纖維素－三（3，5－二甲基苯基氨基甲酸酯）包覆的5μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中，第一次利用填充的微流控芯片（柱長58.4mm）實現了幾種手性藥物的快速拆分，對力莫敵提取物在5s內就可完成拆分。法國GrenobleAlpes大學的Peyrin小組［8］利用毛細管電泳研究了任意選擇的10種具有不同堿基組成、大小、長度和二級結構的寡核苷酸作為手性試劑時對手性化合物的拆分能力。作者采用將寡核苷酸部分填充于毛細管柱的方式，對24種手性化合物進行了拆分。研究結果表明所選擇的寡核苷酸對芳香族小分子化合物都表現出了一定的手性拆分能力。在mmol／LDNA條件下，僅用3種寡核苷酸就可拆分包括藥品、、氨基酸和核苷等在內的21種芳香族手性化合物。這一研究結果表明發展基于核酸的手性拆分方法具有廣闊的應用前景。

4分析檢測

澳大利亞悉尼大學的Handelsman小組［9］采用1，2－二甲基咪唑－5－磺酰氯（1，2－dimethylimidazole－5－sulfonylchloride）作為雌激素衍生化試劑，建立了一種利用LC－MS／MS同時測定血清中衍生化的雌二醇（E2）和未衍生化的睪酮（T）、二氫睪酮（DHT）的高靈敏檢測方法。該衍生化試劑可與雌二醇的酚羥基反應，在質譜分析中可高靈敏度地檢測到質量增加片段。E2、T和DHT的檢出限分別為0.5pg／mL、25pg／mL和0.10ng／mL。隨著納米材料科學的發展，金屬納米粒子的檢測引起相當大的關注。中國地質大學的Zhu等［10］采用一種耦合薄層色譜和激光剝蝕電感耦合等離子體質譜（TCL－LA－ICP－MS）技術對水懸浮液中的納米金進行定量表征分離。該方法已成功地應用于定量表征金納米粒子大小（13、41和100nm）的薄層色譜分離過程，實現了不同粒徑納米金的測定。

5蛋白質組學

多維液相色譜（MDLC）為自上而下蛋白質組學研究中整體蛋白質的分離提供了有力工具。但是二維液相色譜（2DLC）卻無法滿足蛋白質組學復雜樣品中整體蛋白質分離的需要。美國Wisconsin－Madison大學的Ge小組［11］耦合離子交換色譜／疏水色譜／反相色譜（IEC－HIC－RPC）3種色譜分離方法，構建了三維液相色譜（3DLC）用于整體蛋白質的分離，并證明3DLC（IEC－HIC－RPC）技術優于傳統的2DLC（IEC－RPC）。對于HEK293細胞裂解液，前者可鑒定640種蛋白質，而后者只能鑒定出47種。結果表明3DLC技術在自上而下蛋白質組學中對整體蛋白質的分離具有很好的應用前景。蛋白質的磷酸化一直是功能蛋白質組學研究的熱點。美國PolyLC公司的Alpert等［12］比較了靜電排斥親水色譜（ERLIC）和陰離子交換色譜（AEX）兩種分離模式在不同pH條件下對磷酸化肽分離的優劣。在pH＞5時，磷酸化肽帶有2個負電荷，可在AEX柱上保留，但是帶有1個或2個磷酸基團的肽卻無法與含有多個精氨酸和谷氨酸殘基的多肽分離，從而干擾磷酸化肽的鑒定。在pH＝2時，磷酸化殘基僅帶一個負電荷，而精氨酸和谷氨酸殘基不帶電荷，有利于磷酸化肽從未被修飾的酸性多肽中分離。在此條件下，單磷酸化肽基于靜電排斥作用在ERLIC模式下有弱保留。比較AEX和ERLIC兩種分離模式對Hela細胞胰蛋白酶酶解物的分離，ERLIC模式可分離鑒定12467種磷酸化肽，其中包括4233種多個磷酸修飾的肽段。而AEX模式只能鑒定其中的60％。研究結果表明，在低pH條件下，ERLIC模式是對磷酸化肽分離鑒定的最好方法，為磷酸化肽的分離鑒定提供了新思路。

作者：白泉 單位：西北大學現代分離科學研究所，現代分離科學陜西省重點實驗室