香菇液體種生產(chǎn)工藝論文范文

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1實(shí)驗(yàn)方法

1.1菌株活化配制CPDA培養(yǎng)基，接種香菇南山1號(hào)菌株，28℃培養(yǎng)，待菌株滿管后，4℃冰箱保藏備用。

1.2液體母種的制備配制母種培養(yǎng)基，取香菇南山1號(hào)0.5cm2菌塊接種于母種培養(yǎng)基中，靜置24h，28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)10d備用。

1.3生物轉(zhuǎn)化量的測(cè)定將液體條件下培養(yǎng)好的香菇菌絲體抽濾至不滴水，電子分析天平稱重。

1.4單因素試驗(yàn)碳源篩選試驗(yàn)：在碳源篩選培養(yǎng)基中，用10.0g玉米粉分別與麥芽糖、紅糖、蔗糖和葡萄糖各20.0g組合作為碳源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養(yǎng)10d，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，測(cè)定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同碳源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，篩選出最佳碳源組合作為Plackett-Burman設(shè)計(jì)考慮因素。氮源篩選試驗(yàn)：在氮源篩選培養(yǎng)基中，用10.0g麥麩分別與酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0g組合作為氮源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養(yǎng)10d，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，測(cè)定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同氮源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，篩選出最佳氮源組合作為Plackett-Burman設(shè)計(jì)考慮因素。

1.5Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取11個(gè)因素(紅糖、玉米粉、麥麩、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4•7H2O、VB1、初始pH、接種量、溫度、振蕩速度)作為研究對(duì)象，進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，按照表4和表5配制培養(yǎng)基，接液體母種，靜置24h，振蕩培養(yǎng)10d，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，將菌絲球抽濾，測(cè)定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，借助Minitab15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，以及各個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長(zhǎng)及變化方向進(jìn)行試驗(yàn)。針對(duì)影響顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，將正效應(yīng)的值逐步增加，負(fù)效應(yīng)的值逐步減小，設(shè)計(jì)試驗(yàn)找出峰值，以尋找快速最佳的響應(yīng)區(qū)域。每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種后靜置24h，振蕩培養(yǎng)10d，將菌絲球抽濾，測(cè)定菌絲生物轉(zhuǎn)化量。

1.7Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析根據(jù)上述試驗(yàn)，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，采用玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平編碼見表1。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析采用Minitab15軟件和Excel數(shù)據(jù)分析工具中的t−檢驗(yàn)(雙樣本異方差假設(shè))對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同碳源對(duì)香菇菌絲體生長(zhǎng)的影響按照1.2.4方法進(jìn)行試驗(yàn)，觀察不同碳源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，不同碳源對(duì)香菇菌絲體生長(zhǎng)的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以紅糖和玉米粉組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量最高。以麥芽糖和玉米粉組合也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，葡萄糖和玉米粉組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同碳源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長(zhǎng)狀況和生物轉(zhuǎn)化量,可確定紅糖與玉米粉組合為最佳碳源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為27.322g/L。

2.1.2不同氮源對(duì)香菇菌絲體生長(zhǎng)的影響按照1.2.4方法進(jìn)行試驗(yàn)，觀察不同氮源對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，不同氮源對(duì)香菇菌絲體生長(zhǎng)的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以牛肉粉和麥麩組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量高。以酵母粉和麥麩組合作為氮源也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，NH4NO3和麥麩組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同氮源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長(zhǎng)狀況和生物轉(zhuǎn)化量,可確定牛肉粉與麥麩組合為最佳氮源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為30.343g/L。

2.2Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)選用試驗(yàn)次數(shù)n=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察X1(紅糖)、X2(玉米粉)等11個(gè)因素，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素取兩水平，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量Y為響應(yīng)值。同時(shí)借助Minitab15軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過t−檢驗(yàn)從11個(gè)因素中選出了4個(gè)最顯著影響因素，結(jié)果見表4和表5。表4和表5結(jié)果表明，對(duì)香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響的顯著因素：玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的時(shí)候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量的值明顯增加，為正效應(yīng)因素。而X6在量增多的時(shí)候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量反而降低，因此X6為負(fù)效應(yīng)因素。

2.3最陡爬坡試驗(yàn)響應(yīng)面擬合只有在鄰近最大響應(yīng)區(qū)域后才能最好地反映出真實(shí)情況，故要先逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，將玉米粉（X2）、麥麩（X3）和接種量（X11）的值逐步增加，MgSO4•7H2O（X6）的值逐步減小。根據(jù)Minitab15軟件試驗(yàn)分析，其他因素取高水平，結(jié)果見表6。表6結(jié)果表明，在玉米粉24.0g/L，麥麩14.0g/L，MgSO4•7H2O1.1g/L，接種量14.0%時(shí)，測(cè)得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量最大為29.214g/L，所以此為最佳響應(yīng)區(qū)域。

2.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析按照表1中因素水平，借助Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表7。

2.5回歸模型方差分析結(jié)果經(jīng)Design-Expert8.0.6軟件，以玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）為響應(yīng)變量，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量（Y）為響應(yīng)值對(duì)表7結(jié)果進(jìn)行處理，得到表8回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性的二次多項(xiàng)式擬合。

2.6響應(yīng)面及等高值分析結(jié)果根據(jù)回歸方程繪制菌絲生物轉(zhuǎn)化量隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖可知玉米粉、麥麩、MgSO4•7H2O、接種量4個(gè)因素對(duì)香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量的影響(圖1、圖2)。每個(gè)響應(yīng)曲面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立因素間的相互作用，其余兩個(gè)因素保持在編碼水平的0水平。圖1結(jié)果顯示，在一定接種量條件下，隨著玉米粉含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢(shì)；在玉米粉含量較低條件下，隨著接種量的增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢(shì)；在玉米粉含量較高條件下，接種量對(duì)香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響不明顯。圖2結(jié)果顯示，在低硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢(shì)；在高硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢(shì)；在低麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢(shì)；在高麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢(shì)。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，為了降低成本，盡可能使用有機(jī)廉價(jià)的原料，所以在“criteria”選項(xiàng)中選擇MgSO4•7H2O為最小值，玉米粉、接種量、麥麩為平均值，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為最大值，利用Design-Expert8.0.6得到香菇南山1號(hào)菌株液體種的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件：玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L，初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min振蕩發(fā)酵10d，菌絲生物轉(zhuǎn)化量擬合值為49.956g/L。

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件參數(shù)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，最終得到香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004g/L，在初始培養(yǎng)條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為29.214g/L，優(yōu)化后提高了1.75倍。實(shí)測(cè)值與擬合值相比，相對(duì)誤差約為2.098%。該結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體種最佳生產(chǎn)工藝條件是可行有效的。

3結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對(duì)香菇南山1號(hào)菌株液體種生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并得到回歸方程，表明玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）對(duì)響應(yīng)值均有顯著影響，接種量和玉米粉、麥麩和MgSO4•7H2O交互作用顯著。經(jīng)回歸分析并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定香菇南山1號(hào)菌株的液體種生產(chǎn)工藝條件為玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L、初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min搖床發(fā)酵10d，此條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004g/L，比之前得到大幅度提高。實(shí)測(cè)值與擬合值相比，相對(duì)誤差約為2.098%。說明該模型可靠性較高，能很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。相比現(xiàn)有報(bào)道，本研究所得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時(shí)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且成本低，可為香菇南山1號(hào)菌株的液體種生產(chǎn)和栽培提供理論參考。

作者：陳文強(qiáng)喬艷明單位：陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心