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第1篇
Abstract: To increase nitrogen removal efficiency, the study screened a high-efficiency aerobic denitrifier AD-1 in the activated sludge originated from a university previous designed CAAC(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled)reactor treating SWWAE(Soybean Whey Wastewater Anaerobic Effluent). The strain was identified as pseudomonas putida according to the 16S rDNA sequence homology comparison and phyletic evolution analysis. The denitrification efficiency of Pseudomonas putida AD-1 was analyzed in DM medium feeding nitrate as the sole nitrogen source by shake-flask batch culture. After 48h the TN and nitrate removal rate reached 63.31% and 63.35%, respectively. Nitrite concentration was always at low level but fluctuated. At the later culture stage the low CODcr/TN ratio was one of main rate-limiting factors. AD-1 had high-efficiency denitrification with 100% nitrate removal rate in the process of treating SWWAE. Results indicated that AD-1 was a good bioaugmentation agent for SWWAE and other nitrogenous wastewater treatment.
關鍵詞：大豆乳清廢水厭氧出水；好氧反硝化菌；惡臭假單胞菌AD-1；硝態氮還原酶系；亞硝態氮還原酶系
Key words: SWWAE(Soybean whey wastewater anaerobic effluent)；aerobic denitrifiers；pseudomonas putida AD-1；nitrate reductase；nitrite reductase
中圖分類號：G31文獻標識碼：A文章編號：1006-4311（2011）11-0008-03
0引言
脫氮一直是水環境污染治理中的一大難題，隨著大豆深加工業的發展，大豆深加工乳清廢水的排放量與日俱增，乳清廢水中含有的大量CODcr、NH3-N、NO、NO難以及時、有效地處理，由此引起的水體富營養化及養殖水產動物中毒等現象日趨嚴重。作為目前公認的廢水脫氮處理中最經濟、最有效的生物脫氮技術成為研究的熱點[1,2]。傳統生物脫氮采用好氧硝化-厭氧反硝化組合工藝，硝化作用在好氧的條件下將氨轉化為NO/NO，反硝化作用在無分子氧的條件下利用有機物作為碳源，NO/NO作為能量代謝中的電子受體，O2-作為氫受體，合成自身物質或生成N2和H2O，進而達到脫氮的目的。大量的厭氧反硝化菌如Achromobacter, Aerobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus和 Pseudomonas[3]等只有在缺氧或厭氧條件下反硝化基因得以表達，但是其代謝緩慢，脫氮效率低，并且好氧菌與厭氧菌的空間分離培養也增加了脫氮工藝的成本[4,5]。而好氧反硝化菌（Aerobic Denitrifier，AD）和好氧反硝化酶系的發現極大推進了生物脫氮的研究，并受到國內外學者的廣泛關注[6,7]。AD可以在有氧條件下以有機物為電子供體，并且同時以O2和NO/NO為電子受體，產生氮氣。目前已報道的好氧反硝化菌有Alcaligenes faecalis, Citrobacter diversus, Pseudomonas stutzeri和Thiosphaera pantotropha等[8,9,10]。AD可以在同一空間內實現同步硝化-反硝化，避免了系統運行過程中pH的調節，節約了污水處理系統運行成本，而且克服了厭氧反硝化菌生長緩慢，脫氮效率低的缺點[11,12]，為高濃度含氮廢水的處理提供了一條新途徑。
某大學微生物實驗室前期設計開發了處理大豆乳清廢水厭氧出水的CAAC反應器[13]，由移動床生物膜反應器（MBBR）和好氧-厭氧耦合反應器（AAC）串聯組成，反應器在室溫條件下穩定運行近一年，CODcr去除率大于95%，TN去除率高于80%，具備良好的脫氮性能。本研究從中篩選出1株高效好氧反硝化菌，通過16S rDNA方法鑒定菌株的種屬關系，并通過搖瓶批次培養分別考察菌株AD-1對以硝酸鹽為唯一氮源的DM培養基和大豆乳清廢水厭氧出水的反硝化脫氮性能，以期更好地服務于含氮廢水的工程應用。
1材料與方法
1.1 培養基①SM培養基（/L）：檸檬酸鈉8.5g，NaNO30.85g，KH2PO41.36g，（NH4）2SO40.27g，Yeast extract 1 g，MgSO4•7H2O 0.19g；
②溴百里酚藍（BTB）培養基（/L）[14]：L-天冬酰胺 1g，NaNO31g，KH2PO41g，FeCl2•7H2O 0.05g，CaCl2•2H2O 0.2g，Mg2SO4•7H2O 1g，BTB（1%溶于酒精）1 mL，瓊脂20 g，pH7.0～7.3；③LB液體培養基（/L）： Yeast extract 5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；④DM培養基（/L）：KNO3 0.6g，KH2PO4 1g，MgSO4•7H2O 1g，檸檬酸鈉 9.63g。
1.2 實驗方法
1.2.1 好氧反硝化菌的富集、分離及脫氮性能測定污泥取自北京理工大學生命學院微生物實驗室運行的處理大豆乳清廢水厭氧出水的CAAC反應器。投加4g污泥至100mL SM培養基中，置于30℃，170rpm搖床中進行好氧反硝化菌富集培養。48h后取出4mL菌懸液至100mL新鮮SM培養基中在相同條件下培養，如此重復3次。將菌懸液梯度稀釋后涂布于BTB平板培養基中，置于30℃培養箱中培養至長出單菌落，挑取藍色單菌落劃線于LB固體斜面培養基，4℃保存。挑取已保存菌落接種至50mL LB液體培養基中，30℃、170rpm振蕩培養14h。取4mL菌懸液接種于100mL DM培養基中，30℃、170rpm振蕩培養，每12h測定NO3-N、NO2-N、TN及CODCr濃度。
1.2.2 好氧反硝化菌的鑒定菌株總DNA的提取和純化參照文獻[15]。以基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物（正向引物: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物: 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’) 進行PCR擴增，擴增條件：94℃預變性8 min，94℃變性1min，50℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環后72℃延伸10min。1.5kb左右的PCR產物回收采用賽百盛基因有限公司的硅膠膜型PCR產物純化試劑盒，純化產物委托華大基因測序，測序結果在NCBI中比對，挑選數據庫中同源性相近的9株細菌16S rDNA序列系統用于進化發育學分析，用MEGA version3軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型計算進化距離，用Neighbor-Joining構建系統進化樹。
1.2.3 AD-1對大豆乳清廢水厭氧出水的脫氮效率測定取1.2.1 中4mL LB菌懸液接種于100mL大豆乳清廢水厭氧出水（取自某大豆深加工企業污水處理廠）中，大豆乳清廢水厭氧出水的主要成分分析見表1。30℃，170rpm振蕩培養，每12h測定NO3-N、NO2-N及TN含量。
1.2.4 分析方法主要指標分析方法[16]CODCr采用HJ/T 399-2007快速消解分光光度法測定；TN采用GB-T 11894-89堿性過硫酸鉀紫外分光光度計法測定；NH4-N采用氨敏電極法測定；NO3-N采用GB 7480-87酚二磺酸紫外分光光度法測定；NO2-N測定采用GB 7493-87 N-（1-奈基）-乙二胺分光光度法。
2結果與討論
2.1 好氧反硝化菌的分離鑒定通過BTB培養基初篩后得到6株總氮去除率在45%以上好氧反硝化菌，復篩后得到1株高效反硝化菌脫氮效率高于60%，命名為AD-1。圖1為菌株AD-1總基因組電泳圖，以基因組為模板，以細菌通用引物進行菌株的16S rDNA擴增，擴增出大小約為1.5kb左右的片段，如圖2所示。對擴增得到的16S rDN段進行測序分析，測得序列大小為1468bp。通過Genbank數據庫進行Blast比對并構建NJ進化樹，結果如圖3所示，可以看出菌株AD-1與假單胞菌屬(Pseudomonas)中的Pseudomonas putida同源性達到100%，所以AD-1初步鑒定為Pseudomonas putida。
2.2 AD-1菌的脫氮性能測定考察AD-1菌株在60h內以NO為唯一氮源的DM培養基中的脫氮效率及CODcr/TN隨時間變化情況，脫氮效率以TN去除率計，如圖4所示。可以看出AD-1在24h內脫氮效率達到53.2%，48h時達到63.31%，而多數已報道的好氧反硝化菌的脫氮能力在50%左右[17,18,19,20]。而培養液中的CODcr/TN隨時間變化較大。培養初期（0~12h），CODcr/TN高于60，F/M遠遠高于微生物生長所需營養，菌體生長代謝旺盛，微生物數量及多種水解酶大量積累；12h后碳源、氮源迅速消耗，CODcr/TN逐漸下降，反硝化效率提高緩慢；48h后CODcr/TN降低至5以下，下降率為89.78%，導致微生物生長及代謝產酶能力不足，反硝化效率趨于穩定。所以培養后期CODcr/TN下降是影響AD-1反硝化效率的主要因素之一。
圖5考察了NO3-N和NO2-N濃度變化。NO3-N初始濃度為164.00±5.41mg/L，隨著培養時間延長NO3-N去除率逐漸增長，但是受碳源濃度限制，增長率越來越低，48h后去除率達到最高為63.35%。而NO2-N濃度始終保持在較低水平（低于1.6mg/L），與多數文獻研究結果一致[20,21]，但其濃度變化往往被忽視，本研究發現NO2-N濃度呈高低波動狀態，并且振幅越來越小，12h時快速上升至最高值A點而后下降，在48h出現小幅升高至B點的現象。究其原因可能是由于亞硝酸鹽還原酶系的產生需要一定濃度的亞硝酸鹽誘導。當亞硝酸鹽濃度較低時，亞硝酸鹽還原酶系產生慢于硝酸鹽還原酶系；當亞硝酸鹽積累到一定濃度時亞硝酸鹽還原酶系被誘導加速分泌，當其還原效率高于硝酸鹽還原酶系時，亞硝酸鹽濃度減少。亞硝酸鹽濃度變化的振幅越來越小是由于后期碳源缺乏，供能不足，導致硝酸鹽還原酶系產生減少，亞硝酸鹽生成速率下降有關。
2.3 AD-1菌對大豆乳清廢水厭氧出水的脫氮效果大豆乳清廢水中含有大分子蛋白、小分子寡糖、有機酸、色素類物質和鹽類等，而其經厭氧處理后的出水中仍含有較高的COD及一定量的氮素，厭氧出水中的多種復雜成分及酸性條件對微生物生長代謝產生一定影響。本研究考察AD-1菌在大豆乳清廢水的中的脫氮效率，結果如圖6所示。可以看出AD-1菌對大豆乳清廢水中NO3-N去除率在24h時達到近100%，廢水中的非NO3-N含量基本不變。表明菌株AD-1在大豆乳清廢水中具有較好的反硝化特性，但是其硝化功能較差，所以在實際應用中應協同硝化細菌發揮作用，可應用于同步硝化反硝化（SND）等處理工藝。
雖然AD-1菌具有較高的反硝化脫氮性能，但是受CODcr/TN及DO等多種關鍵因素影響，所以為了獲得好氧反硝化菌株最優的脫氮條件，需要進一步優化以獲得最佳CODcr/TN及DO條件，實現AD-1菌脫氮效率最大化。同時，好氧反硝化菌的硝酸鹽還原酶系和亞硝酸鹽還原酶系的產酶動力學方向也具有一定的研究理論價值。
3結論
3.1 本研究自CAAC反應器的活性污泥中篩選出1株好氧反硝化菌AD-1，經鑒定為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。
3.2 在搖瓶批次培養24h后AD-1對DM反硝化培養基的TN去除率為53.2%，48h后達到63.31%，具有較好的反硝化能力。NO3-N在48h時的去除率達到最高為63.35%，亞硝酸鹽濃度雖然始終維持在較低水平卻呈有規律的上下波動狀態。
3.3 48h后CODcr /TN降低至5以下，下降率為89.78%，是AD-1菌株反硝化脫氮的關鍵限速因素之一。
3.4 AD-1菌對大豆乳清廢水厭氧出水24h內NO3-N去除率達到100%，具有較好的脫氮效果。
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第2篇
?親愛的同學們:
近期，網絡貸款迅速在大學生群體中走紅，助長了一些大學生的非理性消費行為，甚至有可能讓他們陷入難以自拔的泥沼之中。2016年3月份，河南某高校大學生小鄭因無力償還68萬元貸款而跳樓自殺，讓名目繁多的校園網貸平臺暴露在公眾視野中。
20xx年5月25日報道，濟南54名大學生被騙百萬元貸款等。當前，校園網貸亂象叢生，相關監管還存在漏洞，甚至有不法分子盜用學生的身份證和學生證等個人信息進行違規貸款，非法獲利，對學生本人的利益和信用造成嚴重的損害。大學生觀念進步，對超前消費等接受程度較高，但因為其沒有固定的經濟來源，而且容易沖動消費，導致大學生成為各類校園貸款平臺的獵物。為此，學校向全體同學發出以下倡議:
一、增強自我保護意識，維護自身權益。我們作為大學生必須具備防騙意識，有效進行自我保護。切勿使用個人信息替他人進行網貸，無論是對承諾提供好處的陌生人，還是關系不錯的熟人，都要有防護意識，切實維護好自身權益。
二、強化責任意識,注重理性消費。作為不具備獨立經濟能力的大學生，仍然需要依靠父母的資助，在生活上不羨慕、不嫉妒、不攀比、不盲從，大家應樹立正確的消費觀念以及生活理念，崇尚節儉，合理消費。
三、強化信用意識，以實際行動踐行誠信。要時刻牢記信用不好會影響自己的一生，切不可讓大學時代的不良信用記錄導致自己進入信用黑名單。
四、遠離網貸，專注學業，做一名文明大學生。目前，國家和學校的資助政策體系已完善，全體學生基本都可以在現有的資助下順利完成學業，因此大家需要把主要精力放在學習上，以優異的成績來回報父母、社會和國家。
同學們，美好的大學生活需要我們每一個人切實的付出和努力，讓攜手共進，用理性辨別是非，用成績回報社會。
2017理性消費倡議書【2】?
?親愛的同學們:
大學生寄托著家庭的全部希望，承載著民族的希望，祖國的未來，任重而道遠。然而，近期關于大學生因 校園不良網貸 而跳樓自殺的事件頻頻曝出，引起了廣泛關注和熱議。當前，校園網貸亂象叢生，不良網絡借貸平臺采取虛假宣傳和降低貸款門檻等方式，誘導學生超前消費、過度消費，嚴重危害了學生的切身利益。現面向全體學生提出倡議:
1、主動學**金融和網絡安全知識，提升防范能力，切勿隨意填寫和泄露個人和他人信息。
2、增強網貸業務甄別和抵制能力，不要盲目信任網貸，尤其警惕熟人推銷，保護自身合法權益。
3、不參與不良網貸活動;不充當不良網貸的宣傳員和者;不使用個人信息替他人進行網貸，也不冒用他人身份信息為自己進行網貸。
4、摒棄攀比心理，自覺糾正超前消費、過度消費和從眾消費等錯誤觀念，理性消費，養成艱苦樸素、勤儉節約的優秀品質。
5、拒絕不良網貸，專注學業，時刻把學業放在第一位，以優異的成績來回報父母、社會和國家。
6、如需貸款，須與家人協商，選擇正規合法的金融機構，按期還款。
同學們，為了保護好自己及他人的財產安全乃至人身安全，讓我們積極行動起來，從現在做起，從你我做起，理性消費，自覺抵制不良網貸，弘揚青春正能量，營造良好的校園安全氛圍。
2017理性消費倡議書【3】?
?親愛的同學們:
近兩年，出現了許多打著零利息、零首付名號的網絡借貸平臺，學生信貸現象也越來越多。隨著我國經濟發展水平不斷提高并加速融入全球經濟，這些信貸固有的風險也隨之上升，有些不法分子甚至會通過貸款獲取個人信息并加以利用。因此，我們必須正視信貸風險、合理使用資產、理性消費。為切實加強同學們的信貸風險意識，積極營造敢貸不濫貸、慎貸不惜貸的信貸環境，在此我們向大家發出以下倡議:
一、正確認識網絡貸款及社會非法小型貸款，遠離網絡及社會非法信貸;
二、高度重視個人身份信息，做好保密工作，謹防身份信息被不法分子利用;
三、理性消費，量入為出，收支平衡，不超前、不預支、不借貸;
四、保護環境，綠色消費。增強可持續的消費理念;
五、遇到困難時，及時向同學、老師、學校尋求支持和幫助;
第3篇
理性消費 拒絕網貸倡議書【一】?
?親愛的同學：
隨著互聯網的發展，一些小額網絡貸款在校園悄然滋生，學生們只需要填寫一些基本資料，拍幾張照片，就可以拿到不等數額的貸款，其實這樣看似方便快捷的小額貸款平臺，處處是陷阱!為增強大學生安全防范意識，拒絕不良網絡借貸，現就校園貸風險防范，對同學們提出如下倡議：
一、理性消費，拒絕攀比。在校生要以學業為重，積累知識，要根據自己以及家庭的實際情況進行消費，避免因跟風或攀比而鋪張消費。
二、如果家庭經濟困難，確實需要貸款，一定要和家長商量好再做決定，可選擇由政府主導，金融機構向高校家庭經濟困難學生提供的校園地國家助學貸款、生源地信用助學貸款，并且要仔細閱讀貸款合同，謹慎貸款，誠信還款。
三、不參與、不宣傳校園貸違規違法活動;不鼓動、不脅迫他人在校園貸中借款;不張貼、不轉發校園貸違規違法信息;不冒用、不頂替他人身份進行校園貸款。
四、大學生創業，可向創業所在地人力資源社會保障部門申請創業(開業)補貼，也可去各國有商業銀行、股份制銀行等申請小額貸款，詳細了解貸款及還款的相關知識，按期誠信還款，保持良好的信用記錄。
希望同學們謹以已經發生的事故、案例為戒，加強對網絡貸款的辨識能力，防范網貸風險，拒絕校園網貸，積極營造良好的校園安全環境!也請大家關注學生資助管理中心的官方微信、官方網站，了解更多有關學生資助的政策和活動!
理性消費 拒絕網貸倡議書【二】?
?同學們：
近期，網絡貸款迅速在大學生群體中走紅，助長了一些大學生的非理性消費行為，甚至有可能讓他們陷入難以自拔的泥沼之中。3月9日，河南牧業經濟學院大學生小鄭因無力償還近百萬元欠款而跳樓自殺的事件，引發人們對大學生網貸的關注。目前，社會上一些不法分子利用學生的社會經驗少，盜用學生的身份證和學生證等個人信息進行違規貸款，非法獲利，對學生本人的利益和信用造成嚴重的損害。
為此，學校向全體同學發出以下倡議：
一、強化自我保護意識，維護自身權益。我們作為大學生必須具備防騙意識來進行自我保護。切勿使用個人信息替他人進行網貸，無論是對承諾提供好處的陌生人，還是關系要好的同學，都要維護自身權益。
二、強化責任意識,注重理性消費。作為不具備獨立經濟能力的我們，仍然需要依靠父母的資助。我們應樹立正確的消費觀念以及生活觀念，切勿攀比消費，要儉樸生活。
三、強化信用意識，以實際行動踐行誠信。要時刻牢記信用不好會影響自己的一生，切不可讓大學時代的不良信用記錄導致自己進入信用黑名單。
