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第1篇

[關鍵詞] 噴霧干燥條件；吸濕性；含水量；吸濕率-時間曲線；吸濕速度

骨痹顆粒復方是由桑寄生、骨碎補、千年健、牛膝、雞血藤、油松節、土鱉蟲等組成的純中藥制劑，臨床上用來治療老年性關節炎具有很好的效果。噴霧干燥是骨痹顆粒制備工藝的重要工序。中藥粉體的吸濕性一直是噴霧干燥領域研究的重點，但其研究內容多為考察不同制劑輔料[1]，以及粉體表面改性技術對中藥粉體吸濕性的影響[2]。本文以骨痹顆粒復方為實驗體系，通過考察不同工藝條件下噴霧干燥樣品含水量與吸濕性能，建立吸濕過程動力學模型，結合掃描電鏡技術，分析相關吸濕機制，為中藥噴霧干燥工藝優化研究提供一種新的方法。

1 材料

BUCHI B-290小型噴霧干燥機（瑞士布奇公司）；S4800掃描電鏡（日本日立公司） ；Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998光電二極管陣列檢測器（美國沃特世公司）；RE52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SK8200H超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；754型紫外分光光度儀（上海光譜儀器有限公司）；賽多利斯MA30快速紅外水分測定儀（德國賽多利斯有限公司）；GQ105管式離心機（上海市離心機械研究所）；島津AUW120D電子天平（日本島津公司）。

川續斷（產地東北，批號111026）；懷牛膝（產地貴州，批號111026）；骨碎補（產地貴州，批號111026）；千年健（產地廣東，批號111026）；雞血藤（產地廣西，批號111026）；土鱉蟲（產地安徽，批號111026）；桑寄生（產地廣西，批號111026）；油松節（產地安徽，批號111026）均購自亳州市中藥材飲片廠，經本校吳啟南教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》（二部）要求。

2 方法

2.1 骨痹顆粒水提液的制備

按如下處方：川續斷（25 g）、懷牛膝（15 g）、骨碎補（15 g）、千年健（15 g）、雞血藤（25 g）、土鱉蟲（10 g）、桑寄生（25 g）、油松節（15 g）稱取總處方量145 g水煎煮2次，每次10倍量水。水提液經過4層紗布過濾得濾過液，旋轉蒸發濃縮到相對密度為1.05 g?mL-1備用。

2.2 噴霧干燥工藝考察因素及其水平的確定

中藥提取液的噴霧干燥工藝研究，一般以進出、口溫度，空氣流量，霧化壓力，送料速度，送料密度及噴霧輔料為考察因素[3-6]。根據預實驗并結合有關文獻，本實驗中選擇進口溫度（A）、送料密度（B）、送料速度（C）、空氣流量（D）4個因素進行考察。為了確定各因素水平的考察范圍，進行了如下單因素實驗。

2.2.1 進口溫度對噴霧干燥的影響 控制送料密度為1.01 g?mL-1，送料速度為15 mL?min-1，空氣流量40 m3?h-1，選取進口溫度分別為110，120，150，180，200 ℃，分析進口溫度對噴霧干燥過程的影響。實驗發現進口溫度為110 ℃與200 ℃時均出現了黏壁現象。為了使客觀存在的差異明顯，在考察溫度的影響時選擇了120，180 ℃這2個水平。

2.2.2 送料密度對噴霧干燥的影響 控制進口溫度為150 ℃，送料速度為15 mL?min-1，空氣流量為40 m3?h-1，選取送料密度分別為1.01，1.03，1.05，1.10 g?mL-1，分析送料密度對噴霧干燥過程的影響。結果顯示，送料密度為1.10 g?mL-1時物料過濃，在噴霧干燥過程中會發生噴頭堵塞的情況。與上同理，送料密度選擇了1.01，1.05 g?mL-1這2個水平。

2.2.3 送料速度對噴霧干燥的影響 控制進口溫度為150 ℃，空氣流量為40 m3?h-1，送料密度為1.01 g?mL-1，選取送料速度分別為5，10，15，20，30 mL?min-1分析送料速度對噴霧干燥過程的影響。實驗發現送料速度為30 mL?min-1時，出口溫度為48 ℃，粉末黏附在噴霧干燥室內壁上；而送料速度為5 mL?min-1時雖然干燥完全，但是噴干效率較低。送料速度選擇了10，20 mL?min-1這2個水平。

2.2.4 空氣流量對噴霧干燥的影響 控制進口溫度為150 ℃，送料密度為40 m3?h-1，送料速度為15 mL?min-1，選取空氣流量分別為20，30，40，50，60 m3?h-1分析空氣流量對對噴霧干燥過程的影響，實驗發現空氣流量為20 m3?h-1時物料完全粘附在內壁。而在其他條件下均正常，但空氣流量在60 m3?h-1時噴干用氮氣使用過快，使空氣流量無法始終保持在高流量，會出現無法準確控制條件的情況。于是空氣流量選擇了30，50 m3?h-1這2個水平。

綜上所述，選擇進口溫度（120，180 ℃）；進樣密度（1.01，1.05 g?mL-1）；送料速度（10，20 mL?min-1）；空氣流量（30，50 m3?h-1）進行以下實驗。

2.3 噴霧干燥實驗設計

以上述因素水平設計平行比較實驗，控制除考察因素以外的條件保持一致，考察不同噴霧干燥因素對粉體含水量與平衡吸濕量的影響。

2.4 粉體含水量與吸濕性的測定

2.4.1 含水量測定 樣品在噴霧干燥完成后，立即采用賽多利斯MA30快速紅外水分測定儀測定水分含量。

2.4.2 粉體的吸濕性測定 中藥粉體的吸濕性能往往采用平衡吸濕量表征，但平衡吸濕量所代表的是物料達到吸濕平衡時的含水量[7]。有些物料雖然平衡吸濕量很大，吸濕過程卻很緩慢；而有些物料在一定短時間內吸濕量猛增，之后卻增長緩慢。所以平衡吸濕量只能衡量吸濕終點物料的特性，而不能反映物料吸濕過程的速度特征。為表征物料吸濕速率，本研究參考文獻[8]，引入吸濕率-時間曲線以及吸濕初速度、吸濕速度、吸濕加速度等參數。以冀能較全面的表征中藥噴干粉的吸濕行為。

平衡吸濕量測定方法：取樣品約300 mg，精密稱量，平攤于稱量瓶中，厚度不超過5 mm，開蓋置于干燥器中48 h脫濕平衡。精密稱重后置于25 ℃，相對濕度75%的恒溫恒濕箱中，每隔一定時間測定，計算吸濕增重，一直維持24 h。

噴霧干燥樣品吸濕率-時間曲線的繪制：計算吸濕率，以吸濕率為縱坐標，時間為橫坐標，繪制吸濕率-時間曲線。吸濕率=（吸濕后樣品質量-吸濕前樣品質量）/吸濕前樣品質量×100%。

吸濕過程動力學分析：粉體吸濕過程數據一般可用多項式方程進行擬合，對噴霧干燥各樣品的吸濕曲線數據進行回歸擬合，可得到如下吸濕方程[9]。

由方程（1）～（3）求算各樣品的吸濕初速度、吸濕平衡時間、吸濕速度與吸濕加速度。

2.5 微粒的形貌觀察

取不同條件下制備的噴霧干燥粉末少許，固定于電鏡樣品臺導電膠上噴金，然后在真空條件下進行成像觀察。

3 結果與討論

3.1 吸濕曲線的繪制與吸濕過程速度方程的計算與比較

骨痹顆粒噴霧干燥實驗結果見表1。

為了表征不同噴霧干燥條件下粉末的吸濕特征，按照表3的擬合方程以2.4.2項下方法進行了數學計算，得到各組不同條件噴干粉末的吸濕初速度與吸濕平衡時間數據，見表4。按照表3的吸濕速度方程繪制出了吸濕速度變化曲線，見圖1。

由表3，4中的數據可知，D2組的吸濕初速度最大，B2組的吸濕初速度最小，D2組的吸濕平衡時間最短，A1組的吸濕平衡時間最長。由表4中可知，吸濕加速度也不像文獻[10]報導的維持在一個恒定的值，以A2組為例，由它的一元二次方程可知其吸濕加速度曲線呈“拋物線”型。即吸濕過程不是一個勻減速過程。由圖1可知，同一組的噴干粉末吸濕速度變化情況也不一樣。此處要說明的是，4組實驗中均出現了吸濕速度變為負值的情況，作者推測這種情況基本排除實驗誤差的情況，原因可能是物料的吸濕性能由化學組成和物理性質共同決定，隨著吸濕過程的進行，中藥出現液化的情況，顆粒的物理結構漸漸消失，便會釋放出一部分水分。由此可見不同噴霧干燥條件下，化學組成相同的噴霧干燥粉體的吸濕過程存在較大差異。中藥噴干粉體的吸濕過程相對復雜，里面可能包含著很多相互影響的作用，其中的具體機制待進一步探究。

3.2 粉體微觀形貌分析

按2.5項下方法，獲取噴霧干燥粉末不同樣品微粒的的掃描電鏡圖見圖2。

溫度下，均出現了較強程度的黏連，結合前面的含水量測定結果分析，認為過低的的進口溫度與過高的進口溫度均不利于噴霧干燥的進行，過低的進口溫度導致含水量過高，而這誘導了粉末的黏性產生；過高的進口溫度使粉末的含水量過低，不僅粉末吸濕活性更強，且粉末易于團聚也會加劇粉末的黏連。不同的進料密度下粉體的粒徑出現了明顯的差異，送料密度為1.01 g?mL-1，粉體的粒徑在1～3 μm；而送料密度為1.05 g?mL-1，大部分粉體粒徑都集中在6 μm左右。不同送料速度下的噴干粉體的形態與粒徑未見明顯差異。不同空氣流速的粉體粒徑也出現了明顯差異，空氣流速30 m3?h-1中大顆粒的數量明顯多，粒徑集中在4～10 μm；而空氣流速50 m3?h-1粒徑明顯偏小，大部分集中在1～2 μm。另外實驗也發現，除了120，180 ℃時粉末發生嚴重黏連之外，其他各組的粉末均呈現出了較優的球狀，一般認為球形顆粒具有更好的粉體學性質，這也說明了骨痹顆粒的噴霧干燥溫度控制在150 ℃左右較為適宜。

3.3 關于吸濕機制的若干分析

整個吸濕過程的主要影響因素有兩大類：一類是制劑原料的物理特性，如制劑原料的孔隙率、含水量，粒徑[11]、粒子的表面性質[12]等；另一類則是由制劑原料的化學特性，如化學基團所決定的制劑原料與水分子之間的吸引力。從本文的實驗結果來看，噴霧干燥條件的不同，造成了粉體物理性質，如含水量、粒徑等的差異，而這些差異也確實帶來了粉體吸濕性能上的不同。

吸附理論[13]認為制劑原料吸濕的主要動力是水的擴散，環境中的水分子吸附于制劑原料表面，隨著水分子濃度的增大，內外壓差促使水分逐步向內部滲透。因而，中藥的吸濕行為可以描述為水分子向內部擴散的一個過程，而此過程可以用FICK′s定理來描述[14]。dw/dt=-DA（dc/dx），式中，w為t時浸膏表面含水量，dw/dt為擴散速度，A為擴散面積，dc/dx為濃度梯度，dc代表表面的水分子濃度，dx表示擴散間距。“-”表示擴散方向為濃度梯度的反方向，即擴散物質由高濃度區向低濃度區擴散，D為擴散系數（其受多方面因素影響，如溫度）。

由FICK′s定律可知，擴散面積、擴散系數、濃度梯度越大，水分的擴散速度越快，也就是吸濕性越強，反之則越弱。所以吸濕曲線的分析結果可以結合圖2和FICK′s定理來得到合理的解釋。

圖2顯示，由于溫度較高，A2組粉末的含水量更低，其表面的活性基團具有更強的吸水活力。所以其在短時間內可以吸附大量的水，具有更高的吸濕初速度10.412 0 g?h-1。當表面吸附一定的水后，由于A2組粉末內部的含水量（2.66%）也很低，造成了內外大的濃度梯度，所以吸濕速度也較A1組更快（由圖1中A圖可以看出）。但隨著內部水分的越來越多，內外水分子濃度梯度的減小，其吸濕速度也急劇減緩。而120 ℃粉末由于內外的含水量（6.79%）均要高，所以無論是外部的吸水速度還是水分向粉體內部擴散的速度都要慢，造成了總體吸濕過程的緩慢，吸濕平衡時間也更長為13.55 h。

圖2中B2組的粉體粒徑要比B1組明顯大，可見相同質量的粉體，B1組的比表面積要比B2組大。由FICK′s定律可知，B1組的擴散初速度與擴散速度要比B2組快。所以B1達到吸濕平衡的時間也更短。這與表4和圖1中B圖的結果相符。在實驗中發現隨著實驗過程的進行，粉體B1出現了部分液化的現象。其原因可能是隨著吸水過程快速進行，誘導了粉體之間的黏性增大，導致粉體之間互相粘附，見圖3。而此過程帶來的影響是擴散表面積減小，擴散速度變慢。與此同時，也伴隨著濃度差的影響，即隨著水分擴散的進行，粉體內外的水分濃度差快速減小，進而導致擴散速度的進一步變慢。圖2中D1、D2也可以通過上述原理來解釋，在此不重復說明。

C1，C2圖中粉體粒徑未見明顯差異，可見進樣速度不同對粉體粒徑的影響不大。由表2知，C1組粉體含水量為3.97%，C2組含水量為4.73%，可見含水量的差異也不大。由表2，3可發現，2組噴干粉末的吸濕擬合曲線很相似，每個時間點的吸濕率也相差較小。C1，C2 2組的上述結果再一次提示了粉體的粒徑差異和含水量是影響粉體吸濕性的主要因素。

綜上所述，根據實驗結果，在本研究的實驗體系中，可得較佳工藝條件為進口溫度150 ℃，進料密度1.05 g?mL-1，進料速度20 mL?min-1，空氣流速30 m3?h-1。在此綜合條件下，得到的粉體具有較優的形態特征，并且具有較優的吸濕動力學過程，包括較小的吸濕速度，與較長的吸濕平衡時間。

4 結論

本文以骨痹顆粒水提液為模型體系考察了噴霧干燥條件對粉體的含水量與平衡吸濕量的影響。研究發現，噴霧干燥諸多工藝條件中，送料密度和空氣流量對粉體的吸濕性影響較大，這對探索中藥物料復雜體系噴霧干燥作用機制，指導實際生產具有參考意義。本研究所采用的研究方法與考察指標，亦可為評價中藥物料改性條件提供借鑒。

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[14] 鄭俊民.藥用高分子材料學[M].北京：中國醫藥科技出版社，2000：156.

Research about effect of spray drying conditions on hygroscopicity of spray

dry powder of Gubi compound′s water extract and its mechanism

ZONG Jie1，2，SHAO Qi2，ZHANG Hong-qing2，PAN Yong-lan1，2，ZHU Hua-xu1，2*，GUO Li-wei1，2*

（1. College of Pharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；

2. Key Laboratory of Chinese Herbal Compound Separation，Nanjing 210023，China）

[Abstract] Objective： To investigate moisture content and hygroscopicity of spray dry powder of Gubi compound′s water extract obtained at different spray drying conditions and laying a foundation for spray drying process of chinese herbal compound preparation.Method： In the paper，on the basis of single-factor experiments，the author choose inlet temperature，liquid density，feed rate，air flow rate as investigated factors.Result： The experimental absorption rate-time curve and scanning electron microscopy results showed that under different spray drying conditions the spray-dried powders have different morphology and different adsorption process. Conclusion： At different spray-dried conditions，the morphology and water content of the powder is different，these differences lead to differences in the adsorption process，at the appropriate inlet temperature and feed rate with a higher sample density and lower air flow rate，in the experimental system the optimum conditions is inlet temperature of 150 ℃，feed density of 1.05 g?mL-1，feed rate of 20 mL?min-1，air flow rate of 30 m3?h-1.

第2篇

【摘要】

目的 觀察放射對小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)體外成骨潛能及體內骨髓造血干細胞(hematologic stem cells， HSCs)龕位的影響。方法 分離、培養正常及接受4Gy放射后不同時間點小鼠BMMSCs，用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色法和實時定量RTPCR檢測成骨分化相關基因，鑒定BMMSCs體外成骨分化潛能的改變，并通過骨組織形態學和免疫組織化學的方法檢測放射后小鼠體內成骨細胞及紡錘形的、表達神經鈣黏附分子的成骨細胞(spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts， SNOs)數量的變化。結果 全身照射(total body irradiation， TBI)后早期小鼠BMMSCs的成骨潛能增強，但隨后迅速降低；TBI后28d小鼠骨髓中成骨細胞和SNOs的數量均顯著減少。結論 4Gy放射損傷后遠期小鼠BMMSCs的成骨潛能顯著降低，體內HSCs龕位也明顯縮小。

【關鍵詞】 目的 觀察放射對小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)體外成骨潛能及體內骨髓造血干細胞(hematologic stem cells， HSCs)龕位的影響。方法 分離、培養正常及接受4Gy放射后不同時間點小鼠BMMSCs，用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色法和實時定量RTPCR檢測成骨分化相關基因，鑒定BMMSCs體外成骨分化潛能的改變，并通過骨組織形態學和免疫組織化學的方法檢測放射后小鼠體內成骨細胞及紡錘形的、表達神經鈣黏附分子的成骨細胞(spindleshaped Ncad

ABSTRACT: Objective To investigate the effects of irradiation on the osteogenesis potential of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and the niche of hematopoietic stem cells (HSCs) in vivo. Methods At the different time points after 4Gy irradiation， BMMSCs were isolated from male C57BL/6 mice and cultured. Their osteogenesis potentials in vitro were evaluated by alkaline phosphatase staining and osteogenesisrelated gene expression was examined by realtime RTPCR. Bone histomorphometric analysis and immunohistochemical staining of the spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts (SNOs) were performed to detect the changes in HSCs niche in vivo. Results Significant impairment of osteogenic differentiation of BMMSCs up to 28 days after irradiation was observed preceded by transitory enhancement at the early time after irradiation. Meanwhile， the number of osteoblasts as well as SNOs in vivo decreased greatly. Conclusion Irradiation resulted in damage in osteogenesis potential of BMMSCs accompanied by noticeable shrinking of HSCs niche in vivo.

KEY WORDS: irradiation; bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs); osteogenesis potential; hematopoietic stem cells (HSCs) niche

骨髓是對放射較為敏感的組織器官，放射后造血系統的損傷不僅包括早期的急性骨髓造血功能抑制，還包括晚期殘存的造血功能障礙。造血干細胞(hematopoietic stem cells， HSCs)凋亡、自我更新能力減低及HSCs池縮小以及HSCs衰老[13]被認為是放射后造血系統短期和長期損傷的主要原因。然而HSCs在體內的存在并不是孤立的，其生物學行為與功能受其所在微環境或龕位(niche)的調控。骨和骨髓在解剖上的毗鄰使其在功能上也相互依賴，成為一個功能單位[4]，骨發育或骨重塑異常的突變小鼠同時也存在造血生成異常，提示成骨細胞和/或破骨細胞參與了骨髓HSCs微環境或龕位的形成和功能維持[57]。目前認為成骨細胞或其中的一個亞群，即紡錘形的、表達神經鈣黏附分子的成骨細胞(spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts， SNOs)作為HSCs龕位的骨龕(osteoblastic or endosteal niche)中的關鍵細胞成分，限定造血龕位的大小和/或活性[5，78]。雖然以往關于大劑量化療和/或放療對骨髓基質微環境的影響有一些報道，但有關放射對HSCs龕位的影響尚未見報道。本研究著眼于成骨細胞的祖細胞——BMMSCs在放射損傷后成骨潛能的變化來探討放射損傷對HSCs龕位的影響，旨在進一步闡明放射損傷后長期造血功能損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及輻射損傷模型制備

5周齡雄性C57BL/6小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所，實驗動物隨機分為正常對照組和全身照射組，后者經137Cs射線進行一次性全身照射4.0Gy，吸收劑量率為2.4Gy/min。每批動物分別在照射后的0、1、3、7、14、28d取材，所得到的BMMSCs分別命名為D0、D1、D3、D7、D14和D28。

1.2 主要試劑和儀器

Flk1抗體(美國Santa Cruz 公司)；CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b抗體(晶美生物工程有限公司)；Realtime PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)；Realtime PCR儀(ABI PRISM7500，美國Applied Biosystems公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(中國醫學科學院血液病研究所科技公司)；兔多克隆抗NCadherin抗體(英國Abcam公司)；即用型過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(Zymed公司)；PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.3 小鼠BMMSCs的分離和培養

無菌狀態下取雄性C57 BL/6小鼠股骨和脛骨，沖出骨髓，經4號針頭反復沖洗，制成單細胞懸液。用FicollPaque(1.077g/mL)分離出骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells， BMMNCs)，用MACS CD45、GlyA和CD34磁珠去除造血細胞，以107個/mL密度接種在25cm2的培養瓶內。培養液成分為400mL/L MCDB、550mL/L DF12、40mL/L胎牛血清、100u/mL青霉素和1000u/mL鏈霉素，置于37℃、50mL/L CO2培養箱培養。24h后去掉懸浮細胞，細胞融合達70%時，用1.25g/L胰酶消化并以1∶2比例傳代。這些細胞的免疫表型為CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b陰性，Flk1陽性(資料未顯示)。

1.4 成骨的定向誘導分化

以2×104/cm2的密度將小鼠BMMSCs接種于含有成骨誘導培養體系(100mL/L胎牛血清、1.0×10-8mol/L地塞米松、2.0×10-4mol/L抗壞血酸、7.0×10-3mol/L β磷酸甘油的IMDM培養液)的T25cm2培養瓶或35cm2的培養皿中，置于37℃ 50mL/L CO2、飽和濕度的CO2培養箱內培養，每天觀察1次，每3d半量換液1次。

1.5 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色

正常及全身照射(total body irradiation， TBI)后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs體外成骨誘導分化1周時傾出培養皿中的培養液，PBS洗細胞2次；加固定液2mL，室溫固定1min，流水漂洗2min；加作用液2mL，置濕盒內于37℃孵育2h，流水沖洗2min；加染色液2mL，復染5min，流水沖洗2min；甘油封固，倒置顯微鏡下觀察，胞質出現藍紫色沉淀的為陽性細胞。

1.6 熒光實時定量RTPCR(real time RTPCR)

正常及照射后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs體外分別成骨誘導1周或3周后，用Gibco公司的Trizol regeant提取其總RNA，參照說明書逆轉錄后的cDNA產物，以βactin為管家基因，應用嵌入熒光染料SYBR Green I進行熒光定量PCR擴增，檢測成骨分化相關基因核心結合因子(corebinding factor 1， Cbfa1)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen， ColⅠ)和骨鈣蛋白(osteocalcin， OC)的表達變化。25μL擴增體系中含ROX 0.5μL，2×Premix 12.5μL，上游和下游引物各1μL，模板cDNA 1μL，DEPC水7μL。所用引物及退火溫度見表1。表1 用于實時定量RTPCR的成骨分化相關基因引物序列（略）

1.7 骨組織標本的制備及蘇木素

伊紅染色(HE染色) 在放射后不同時間點處死模型和正常小鼠，取出股骨，剔除骨表面附著的軟組織，按常規的方法制備5μm的脫鈣石蠟切片，進行HE染色，并參照ZHANG等[8]的方法，計數每張切片中皮質骨和小梁骨表面成骨細胞數。

1.8 NCadherin陽性細胞的免疫組織化學檢測

上述脫鈣的石蠟包埋的骨組織切片常規脫蠟至水，按照試劑盒說明書，采用SP法進行NCadherin的免疫組織化學染色，微波煮沸抗原修復。兔多克隆抗NCadherin抗體的濃度為1∶200稀釋。顯色采用DAB法并經蘇木素復染，參照ZHANG等[8]的方法，計數每張切片的SNOs。每次都做不加一抗的陰性對照片。

1.9 統計學分析

實驗數據采用均數±標準差表示，應用SPSS12.0軟件進行統計學處理，多個樣本均數的比較采用方差分析，兩兩比較采用StudentNewmanKeuls法(SNK法)，以α＝0.05為顯著性檢驗水準。

2 結果

2.1 放射損傷后小鼠BMMSCs成骨潛能的改變

接受4Gy放射后小鼠BMMSCs體外均能向成骨細胞分化，但其分化潛能卻存在著較大差異。放射前后不同時間點BMMSCs在成骨誘導培養基中誘導1周后，細胞變大，扁平(圖1)，進行ALP染色，發現ALP陽性細胞的數量在放射后第3天BMMSCs的成骨分化體系中明顯增多，聚集成片，且著色較深(圖1C)，而在放射后第7天BMMSCs的成骨分化體系中明顯下降(圖1D～圖1F)，至放射后28d時仍未見明顯恢復(圖1F)。

2.2 放射損傷后小鼠BMMSCs成骨分化相關基因表達變化

成骨細胞分化過程伴隨著一些成骨分化相關基因的表達。體外成骨誘導1周后，與成骨分化相關的Cbfa1、ColⅠ和OC在放射損傷后第3天BMMSCs中表達最高，第28天表達最低。在成骨體系中培養3周，TBI后3d BMMNCs Cbfa1的表達仍然最高，但ColⅠ和OC的表達最低；不同的是ColⅠ和OC的表達在TBI后28d達高峰，TBI后3d最低(圖2)。提示雖然放射損傷后早期小鼠BMMSCs的成骨分化潛能明顯增強，但最終其成骨分化的能力顯著降低，在放射后28d未見恢復的傾向。

2.3 放射損傷后體內骨組織形態學和成骨細胞的改變

正常小鼠股骨近端干骺端骨小梁豐富，骨小梁排列以縱向為主，之間互相連接，形態結構完整(圖3A、圖3F)。而放射損傷后，股骨近端干骺端骨小梁排列逐漸稀疏，間隙增寬，形態結構性差，皮質骨變薄。部分骨小梁斷裂及部分區域骨小梁消失出現于放射后第7天(圖3C、圖3H)，以第28天時表現最為顯著(圖3E、圖3J)。

正常小鼠成骨細胞緊密地排列于骨小梁和皮質骨表面(圖3A、圖3F)，而放射后骨小梁和皮質骨表面成骨細胞逐漸減少直至消失(圖3B～圖3E、圖3G～圖3J)。計數正常和放射后第28天時每張HE染色切片的成骨細胞數量可見TBI后28d時小鼠體內成骨細胞的數量顯著減少(圖5A)。

2.4 放射損傷后HSCs龕位的改變

近來認為成骨細胞的一個亞群，即SNOs是HSCs龕位中骨龕的關鍵細胞成分[5，78]。正常小鼠骨髓中骨小梁表面含有較多的NCadherin+細胞，包括SNOs和NCadherin+、卵園形的成骨細胞(圖4A)。而放射后28d，皮質骨及骨小梁表面成骨細胞數量顯著減少(圖3B～圖3E、圖3G～圖3J)，僅在骨骺和皮質骨交界處骨小梁相對較豐富的地方可見到少量的SNOs(圖4B)，其數量較正常減少近70%(圖5B)。

3 討 論

隨著對BMMSCs生物學特性和HSCs龕位研究的深入，BMMSCs在造血功能的起始和維持中的作用逐漸被認識。BMMSCs能生成絕大多數的骨髓基質細胞，構建HSCs賴以生存的微環境[910]，并且它還是成骨細胞的來源，而后者則被認為是HSCs龕位中的關鍵細胞成分，參與對HSCs的調控[5，78]。已有研究證實BMMSCs不僅為一些疾病的治療帶來了新的希望[11]，其生物學特性的改變還參與了一些疾病的發生和發展[1213]。本研究發現放射損傷晚期BMMSCs成骨潛能明顯降低，同時體內成骨細胞數量明顯減少，HSCs龕位顯著縮小。

體外誘導成骨分化1周時，放射損傷后晚期(28d)BMMSCs的成骨分化體系中ALP陽性細胞數量明顯減少，其成骨分化相關基因的表達均顯著低于正常。ColⅠ是成骨分化過程的早期標志之一，在鈣質沉積將結束時表達降低，而OC在成骨分化的終末階段即分化至骨細胞和骨襯細胞時則不表達。本實驗顯示體外誘導分化3周即成骨細胞分化以成熟基質礦化為特征時，TBI后28d BMMSCs成骨分化相關基因ColⅠ和OC高表達，提示分化的成骨細胞仍然處于一個早期的不成熟階段，說明放射損傷后BMMSCs的成骨分化潛能明顯減弱。而在放射后早期(3d)，BMMSCs的成骨潛能有明顯增強，這可能是因為機體受到放射損傷后，BMMSCs通過成骨能力的增強來盡力維持體內骨髓微環境的穩定，但是這種代償功能是有限的。

近年關于HSCs龕位的研究取得了突破進展。在一些特殊的轉基因小鼠模型中，成骨細胞數量的增加或減少直接與HSCs數量增加或減少相關[5，78]，說明成骨細胞是HSCs龕位的重要組成部分，參與限定HSCs龕位的大小和/或活性。ZHANG等[8]證實HSCs通過同型的NCadherin分子和成骨細胞接觸，進而提出了骨內膜表面的專職SNOs是HSCs龕位的必需成分。NCadherin同時表達于SNOs和HSCs，這種同型的NCadherin分子間的相互作用可能在HSCs錨定(anchor)于骨龕中起重要作用。βcatenin是HSCs自我更新的關鍵調控因子[14]，而在許多類型的細胞中，NCadherin和βcatenin構成了一個功能性的信號通路復合體，因而在HSCs龕位中，NCadherin介導的成骨細胞和HSCs的黏附可能通過βcatenin與WntLEF1Notch 1信號通路相連，維持HSCs的自我更新能力，防止其分化。本實驗結果顯示放射損傷后除了骨髓內骨組織形態學發生顯著變化外，放射后第28天，成骨細胞也顯著減少，而SNOs僅見于骨骺和皮質骨交界處骨小梁相對較豐富的地方，其數量也減少近70%，提示TBI后骨髓HSCs的骨龕也顯著縮小。

HSCs和其龕位是一個功能整體，任何一方的改變均會導致造血系統功能損傷。雖然以往認為HSCs本身自我更新能力減低、HSCs池的縮小以及HSCs細胞衰老[14]是放射損傷后遠期造血功能損傷的機制，然而本實驗結果提示放射損傷后BMMSCs成骨潛能的改變及其所導致的HSCs龕位的顯著縮小可能也是導致放射后遠期造血功能障礙的潛在機制之一。

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第3篇

你可曾有過這樣的減肥經歷:無論當初的決心多么堅決,最終還是會屈服于美食的誘惑?據英國媒體報道,牛津大學和英國醫學研究理事會的最新研究證實,一種與肥胖有關的基因能通過促進食欲使我們發胖。換言之,正是因為人體內攜帶這種“貪吃基因”,使得人們的節食努力往往以失敗告終。

這種名為FTO的等位基因最早發現于2007年,它定位在人體第16號染色體上,有分別來自父母的各一個副本。調查顯示,多達14%的英國人兩個FTO基因副本均出現變異。跟沒有變異副本的人相比,他們的肥胖風險增加了70%,罹患糖尿病的風險增加了50%。有49%的英國人攜帶一個FTO基因變異副本,他們患肥胖的可能性跟正常人相比要多30%,而患糖尿病的可能性則多了25%。科研人員認為,FTO是一種與肥胖有關的最普遍的基因。

據英國醫學會研究理事羅杰?考克斯介紹,這一研究使人們重新認識到,僅僅鍛煉或節食來對付肥胖并不奏效。科研人員目前正致力于研究如何通過藥物或者其它方法“關閉”這種基因,從而在根本上解決減肥反彈問題。

手機影響心理健康

“喂,喂,你說什么?信號不好,聽不見!”類似的場景無論在電視上還是生活中都很常見。研究發現,手機對現代人的影響超過錢包,手機丟了,大多數人不到一小時就會發現,而錢包丟了,可能一兩天才會發現。日前,某雜志撰文指出,手機不僅拿在手里,也可能“長”在心里,對心理健康造成不良影響。不少人老是聽到手機在響,掏出手機看,卻并沒有來電或短信。這是一種“手機幻聽癥”,在高級白領、媒體人員以及銷售業務人員中很常見。長時間的幻聽,會使人過度緊張,產生煩躁、焦慮等情緒。因此,癥狀較輕者,不妨養成睡覺前關機的習慣,用健康的方式使用手機,更好地緩解壓力。情況嚴重者,則應該考慮去尋求心理醫生的幫助。

早睡早起 有助成功戒煙

美國一項最新研究表明,“夜貓子”(喜歡熬夜的人)比“百靈鳥”(喜歡早起的人)更容易吸煙上癮,而且戒煙難度更大。

研究人員對23000多對雙胞胎進行了長達30年的跟蹤調查。結果發現,“夜貓子”成為癮君子的可能性比“百靈鳥”更大,吸煙上癮后戒煙成功率更低,而且更容易產生尼古丁依賴癥。

研究人員表示,一種可能是,由于尼古丁會讓吸煙者在夜晚保持清醒狀態,因此“夜貓子”更可能用吸煙來提神。另一種可能是,“夜貓子”更可能去酒吧和餐館等吸煙環境,這也增加了他們吸煙上癮和戒煙難的可能性。另外,“夜貓子”尋求上癮行為的可能性更大,理由是其大腦中的多巴胺和類鴉片物質發揮著重要作用。因此,“夜貓子”要想徹底戒煙,最好改變“睡眠模式”,嚴格早睡早起,這必然會大大提高戒煙成功率。

電腦族常吃黃花菜可預防電腦臉

心理學專家研究發現,經常與電腦打交道的人,由于長時間面對沒有生命的電腦屏幕,而與人的交流越來越少,會在不知不覺中生出一張表情淡漠、冷峻的“電腦臉”。

國外兒科醫生新近發現,人的笑容與鐵質有關聯。研究資料顯示,凡是面帶微笑、眼球靈活、目光炯炯有神的嬰兒,其體內的鐵貯存多數正常;相反,面孔嚴肅、呆板,或1小時內僅發笑1～2次的寶寶,血中鐵含量可能不足。因此,要把缺少笑容作為體內缺鐵的一個早期警報。

人們都知道菠菜富含鐵,其實,黃花菜中所含的鐵是菠菜的幾十倍。古人曾給黃花菜(金針菜)起名叫忘憂、療愁,這足以說明黃花菜的功效。在我國的徐州,有道傳統名菜“軟炸黃花菜”,用黃花菜做主料,因外以雞蛋糊裹炸,食之軟嫩而得名,最適合“電腦族”們吃。

秋天出生的孩子更易食物過敏

英國《流行病和公共衛生雜志》刊登的一項最新研究顯示,秋天出生的孩子發生食物過敏危險更大。

芬蘭奧盧大學研究人員調查了2001年4月至2006年3月出生于芬蘭東南部的近6000名兒童。研究發現,在母親子宮內11周時正值4~5月份的孩子中,食物過敏幾率為11%。而母親懷孕11周時候正好是12月或1月的孩子中,食物過敏發病率只有6%。

研究人員對研究期間花粉水平進行分析發現,4~5月份正是樺樹和赤楊花粉的高峰期。早期研究已發現,孕期接觸花粉會增加孩子食物過敏危險。研究人員發現, 4~5月份母親妊娠11周的時候接觸花粉最多,孩子發生牛奶和雞蛋過敏的危險,比母親妊娠11周時為12月到1月的孩子高3倍。

減慢呼吸有助緩解疼痛

美國一項最新研究發現,減慢呼吸可以在一定程度上幫助人們緩解疼痛感。研究人員分別選取了兩組年齡在45歲至65歲之間的女性進行研究,其中一組為受到慢性疼痛困擾的纖維肌痛綜合征患者,另一組為健康女性作為對照。

實驗過程中,這些女性在呼吸正常和呼吸速度減半狀態下,其手掌分別受到適度的熱脈沖的沖擊。每一次熱脈沖之后,研究人員都會記錄下她們報告的掌部疼痛感程度以及情緒的變化等參數。結果發現,對于健康女性來說,當減慢呼吸時,她們感覺到的疼痛程度也隨之降低。而對于患病一組的女性來說,整體上的作用不很明顯,但那些情緒相對樂觀的患者,也能借助減慢呼吸緩解其疼痛感。

研究人員說,這一研究結果可以幫助解釋為何瑜珈等一些活動通過調整呼吸來放松身心,提升情緒。

烤肉醬汁能減少致癌物質

肉類在烤、煎、炸等高溫烹調時,會產生一種叫做雜環胺的物質。這種物質在體內蓄積,可能誘發胃癌、腸癌等多種癌癥。

美國堪薩斯州立大學的研究人員將鮮牛肉和用調料腌過的牛肉燒烤后,對比二者的雜環胺含量。發現腌過的肉高溫燒烤后,所含雜環胺比未經腌制的低40%以上。經過對多種調料的測試發現,用孜然、咖喱、迷迭香腌過的肉,高溫烹調后產生的致癌物最少。這是因為,烤肉醬中所含的淀粉、糖分等成分在受熱的時候首先吸收熱量,可以保護中間的肉塊不會驟然受到高溫,從而減少了致癌物質產生的機會。另外,烤肉醬中含有的一些有益成分,也是阻礙致癌物質產生的原因。這些食品配料本身均有一定的抗癌防癌作用,也有益于預防高溫加熱食物對人體的危害。

因此,建議在燒烤、煎炸肉類前,放些調料腌半小時,不僅味道好,還可減少致癌物產生。

“邊吃邊K”有傷胃健康