百合響應非生物脅迫的分子機制探討范文

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摘要：非生物脅迫嚴重影響了百合的生產、生長發育過程，百合有應對高溫、寒冷、干旱、高鹽或激素ABA等非生物脅迫的能力，百合可以通過脅迫信號感知、信號激活、信號轉錄和轉導，并通過一系列相應脅迫的基因的表達以及生理反應來響應非生物脅迫。百合對非生物脅迫的響應過程比較復雜，響應過程分為脅迫信號的接受與感受，信號的轉導，轉錄調控基因的表達。本研究分別從轉錄組測序和蛋白質組學方面，對百合響應非生物脅迫的基因表達機理及百合在非生物脅迫分子機制成果進展進行總結闡述，并討論了培育抗逆性強的百合品種的前景，為百合分子育種提供理論參考。

關鍵詞：百合；非生物脅迫；信號轉導；轉錄因子；差異

蛋白百合在中國市場是重要的球根花卉，不僅是世界著名的切花品種，也可以作為盆花栽培，同時也廣泛應用于園林綠化建設中。但是，溫度和干旱是限制百合地域分布的生態因子，非生物脅迫直接影響百合生長和發育及產量，甚至會引起百合生理失衡，是降低百合觀賞價值的主要原因(黃潔等,2012)，因此非常有必要提升露地栽培百合的抗逆性。本綜述從百合響應非生物脅迫分子機制方面的研究進行闡述，旨在為提升百合響應非生物脅迫提供研究基礎和方向。

1百合對非生物脅迫的信號轉導

百合受到低溫脅迫后，細胞中的水分交換和營養吸收受到了極大影響；細胞膜的流動性、滲透作用、細胞質中的物質代謝、核酸的代謝組合都受到了直接影響。并對細胞的物質與能量代謝有一定的影響。但百合可以通過機體一系列的反應抵抗外界低溫脅迫。百合對低溫脅迫的響應脈絡十分復雜，主要通過低溫信號的感受、多種分支途徑的信號轉導、轉錄因子的轉錄調控、抗脅迫基因的表達、物質代謝與滲透作用等多種方式，從而令百合具有一定的抵抗脅迫能力(李宏宇等,2006)。低溫信號可以通過非ABA、ABA及Ca2+信號等途徑進行轉導。許多研究已經驗證得出了百合冷誘導途徑和調控誘導的基因以及冷誘導轉錄因子，它們可以通過不同途徑調控百合響應非生物脅迫，并具有十分顯著的效果。

1.1百合在非生物脅迫下的Ca2+信號轉導

百合在受到外界低溫脅迫后，冷信號分子會與受體結合，并調節細胞代謝、運動、分化等一系列反應，因此了解信號分子的調節過程是探究冷信號傳導途徑的重要過程。百合細胞中的PIP1和PIP2是細胞質膜的組成成分之一，由它構成的膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP)可以衍生信使傳導細胞外界冷信號因子。在低溫條件下，PIP1和PIP基因可以通過編碼質膜蛋白(Inositol1,4,5-trisphosphate(IP3))刺激百合中的蛋白激酶和鈣離子Ca2+信號通路做出響應(Stieberetal.,2004)。在野生卷丹的轉錄組測序中，發現兩個PIP基因(Contig1854,Contig1406)出現轉錄調控表達上調。當發生低溫脅迫時，LlPIP1和LlPIP2基因可以編碼質膜蛋白IP3刺激卷丹中的蛋白激酶和鈣離子做出響應，因此LlPIP1和LlPIP2基因能夠起到十分重要的信號轉導作用。百合在低溫脅迫下，細胞中的鈣離子Ca2+作為第二信使在受到低溫脅迫后，Ca2+濃度會迅速增加，并攜帶著低溫信號從細胞外傳遞到細胞內，引起轉錄調控等一系列的信號轉導與基因表達。在這一過程中，CDPK基因(鈣依賴性蛋白激酶)是Ca2+通路重要的傳感器。Wang等(2014a)通過對卷丹的轉錄組進行測序，能夠發現在低溫脅迫初期，兩個CDPK基因表達量明顯上調(Contig22048,Contig2751)，說明CDPK基因的與冷信號轉導途徑有關，它是可被冷信號激活的ABA誘導型啟動子。

1.2百合在非生物脅迫下信號轉導中ABA響應

植物響應外界非生物脅迫的過程較為復雜，激素脫落酸(ABA)能夠在植物細胞響應低溫脅迫中發揮重要的作用(黃云吉等,2015;姚攀鋒等,2016)，它是百合響應外界低溫脅迫的重要信號因子，一般是通過兩大類信號通路調控：ABA依賴性途徑(ABA-de-pendentpathway)和ABA非依賴獨立的途徑(ABA-in-dependentpathway)。一方面，ABA依賴性途徑中內源ABA含量在冷誘導時期能夠顯著提升，意味著低溫會刺激百合產生更多ABA信號因子，并促使ABA介入信號轉導，ABA因子可以誘導相關基因表達量增加或者減少(AgarwalandJha,2010)。ABA依賴性途徑的反應途徑如下：在ABA依賴性途徑中，磷酸蛋白酶(PP2C)的表達量逐漸下降，并顯著影響了ABA信號的轉導(FowlerandThomashow,2002)。在‘卷丹’的低溫脅迫研究中，陳麗靜等(2011)發現2個被鑒別的PP2C基因(Contig24025,Contig19208)在冷應激反應中的表達量降低，倍數變化僅為0.35，說明‘卷丹’中PP2C基因起到了轉導ABA信號的作用。轉錄因子基因LlNAC和LlBZIP(Contig20596,Contig12014)能夠作用于A-BA依賴性途徑，使其表達量發生改變，變化倍數分別是0.46和1.56，緊接著它們可以促進生成LlNAC1蛋白和LlZIP蛋白(Yoshidaetal.,2002)。‘卷丹’在非生物脅迫下信號轉錄中的Ll1R-MYB1，LlR2R3-MYB，LlMYBR，19208LlAPL(Contig22140,Contig18508,Con-tig1641,Contig20641)是MYB家族的主要轉錄因子，其表達量變化倍數分別是1.01，6.30，1.85和2.92。因此可以說明，‘卷丹’在低溫脅迫條件下，LlCBL，LlAP2/EREBP，LlNAC，LlBZIP和LlR2R3MYB基因的轉導也能夠在ABA信號通路中發揮出關鍵的效果。另一方面，非ABA途徑可以依靠啟動子誘導基因表達來反饋冷脅迫(ShinozakiandYamaguchi-Shi-nozaki,2007)。非ABA途徑的冷誘導基因的啟動子包含三個主要順式作用元件，分別是CIS-actingelements，DRE(dehydration-reponsiveelement)/CRT(C-RepeaT)和ABRE(ABA-responsiveelement)，這三個啟動子都會誘導下游脅迫基因的表達(Pangetal.,2013)。吳小萍等(2006)的研究表明，東方百合中LoCBF基因和‘卷丹’LlDREB1的表達量都發生了變化。根據陳麗靜等(2011)的研究推測，DREBL基因可以和Ll-CIS基因(Contig8665)相結合，并誘導LlCOR12和LlDRE2(Contig13202_All,Contig12185)的表達量提升。另外，Liu等(2014b)的研究還發現了一個大基因家族LlAP2/EREBP(Contig10652_All)，LlERF2，LlERF3，LlERF5，LlERF10和LlmTERF轉錄因子都在非ABA途徑進行表達。Wang等(2014a)研究證明了在適當的條件下，低濃度的外施激素脫落酸ABA可以使卷丹和東方百合‘Sorbonne’的部分基因表達量上調，能夠在一定程度上促進百合提升抗寒及抗旱的能力。因此可以推測其原因為ABA激素可以刺激含有ABA應答元件(ABREs)的啟動子區域的下游冷脅迫基因進行表達。該研究也驗證了外施ABA激素可以提高百合體內抗氧化酶SOD和APX的活性，促進細胞膜的抗氧化系統發揮作用，并通過滲透調節作用防止細胞結構受到破壞，從而維持細胞的正常物質代謝。

1.3百合非生物脅迫下蛋白激酶的響應

由于外界低溫環境會刺激卷丹細胞產生冷信號因子，細胞膜上的接收器或傳感器(Sensor/Receptor)對冷信號因子進行傳導，這時冷信號因子會在催化蛋白激酶的作用下從細胞質傳遞至細胞核(Pilaretal.,2008)，此時信號轉導在蛋白激酶C和磷酸蛋白酶(PP2C)的雙重促進下，能夠誘導轉錄因子LlR2R3-MYB，LlNAC，LlAP2/EREBP，LlDREB1，LlBZIP等通過Ca2+通路和ABA依賴途徑進行表達(Chinnusamyetal.,2007)。緊接著這些轉錄因子能夠促進下游冷誘導基因LlNAC，LlZIP，LlERF，LlMYB-DNA蛋白，LlNAC1的表達來應對低溫脅迫。轉錄因子也會誘導LlCLS，LlFAD3，LlP5CS，Llβ淀粉酶基因等基因的表達(孫紅梅等,2005)，促進了細胞滲透調節作用和碳水化合物代謝等植物生理作用，從而使卷丹逐漸與低溫環境相適應并具備較強的抵御低溫脅迫的能力(Degenkolbeetal.,2012)。

2百合響應非生物脅迫響應的基因調控

2.1百合響應非生物脅迫的轉錄因子調控

在自然條件下，百合除了會受到低溫脅迫，還會受到高溫脅迫、干旱脅迫、高鹽脅迫和激素脅迫等非生物脅迫(Abioticstress)。近年來，隨著環境惡化與極端天氣的頻繁出現，非生物脅迫對百合的生產與生長發育造成了嚴重制約與威脅，因此研究百合對非生物脅迫產生的響應與變化十分重要，探究百合對非生物脅迫響應的基因調控機理。轉錄調控對百合響應非生物脅迫起著承上啟下的作用，并且轉錄因子(transcriptionfactor,TF)在轉錄調控中扮演著重要的角色。為了確保目的基因能夠在特定的條件下表達出相應的蛋白質分子，轉錄因子在與順式作用元件中的啟動子進行結合時可以與其他相關蛋白相互影響，從而改變基因的轉錄過程(曹紅利等,2012)，一方面可以增加或減少同類性狀相關基因的表達量，另一方面也影響了若干與同類性狀相關基因的表達，以更好地響應外界非生物脅迫。Iwase等(2011)對百合轉錄因子的研究表明，在非生物脅迫下，卷丹可以借助信號傳遞的方式對非生物脅迫信號做出應激反應，從而激發轉錄因子與相應的順式作用元件進行結合，并轉錄表達相關蛋白基因，具體的轉錄因子包括LlNAC，LlWRKY，LlDREB，LlMAPK，LlAP2/EREBP等。當百合受到非生物脅迫的影響時，細胞傳感器會接收到第二信號傳感，從而改變細胞內的滲透壓，并隨后引發氧化應激反應(王晶懋,2015)。在這一過程中，細胞膜上面的調控功能基因和結構蛋白的基因如LlRTPK(受體絲氨酸threonine-protein激酶)，LlCLAVATA(受體蛋白激酶CLAVATA1)，LlPTA(phospholipid-transportingatp酶)，LlSOS(Ca2+傳感器)，LlCDPKs(calcium-dependent蛋白激酶)開始進行表達調控。參與信號轉導的轉錄因子包括：LlAP2/EREBP轉錄因子(乙烯反應元件結合蛋白)，LlDREB/CBF(脫水反應元件結合蛋白)，LlCBL5(CBL-inreracting蛋白激酶5)，LlWRKY(WRKY轉錄因子)，LlMAPK(增殖蛋白激酶)，LlGAGA(GAGA-binding轉錄因子)和LlR2R3-MYB(R2r3-myb轉錄因子)。這些轉錄因子可以向下游進行信號轉導并誘導相關應激蛋白基因的反應和表達，主要誘導LlHSP，LlNAC，LlCOR12，LlNADPH和LlNAC1相關基因的表達(Ouellet,2002)，這些基因能夠調控蛋白質合成、離子和水運輸、活性氧的清除和解毒(圖1)。另外，細胞內穩態的重建、增加細胞間滲透保護劑、膜的表達、聚胺類物質合成、碳代謝和細胞凋亡等都是百合細胞抵抗外界非生物脅迫不可或缺的一部分。

2.2百合響應非生物脅迫的下游脅迫基因分析

通過對百合的轉錄組測序，Wang等(2014b)發現了野生百合卷丹、東方百合‘Sorbonne’和亞洲百合‘Tiny’的非生物脅迫基因，其中冷脅迫轉錄因子基因有：LlAP2/EREBP、LlNAC1、LlR2R3-MYB等，與抗性相關的蛋白基因有LlNAC、LlHOT、LlMYBR、LlNAC1、LlLTR、LlLRR、LlDEA，以及GAGA，IAA-IAA，ABAABA等激素代謝相關基因。這些非生物脅迫基因對百合在非生物脅迫期間的信號轉導、轉錄表達、抗性基因的表達及物質能量代謝都有直接或間接的作用，具有重要的參考價值(圖1)。該研究對百合非生物脅迫基因Unigene進行了功能注釋(表1)，發現它們與碳代謝過程、植物激素信號轉導、次級代謝合成等脅迫響應機制有關，并與嘧啶代謝、核糖體形成、氨基酸合成、mRNA通路等信號調節途徑關系密切(Liuetal.,2014a)。

2.3百合響應非生物脅迫的GO功能分析

在對野生百合‘卷丹’、東方百合‘Sorbonne’和亞洲百合‘Tiny’進行同源性分析和GOUnigene的研究中，發現野生百合‘卷丹’具有最小的GOUnigene總量，但它的催化活性(Catalyticactivity)和信號轉導(Transporteractivity)功能基因比重在三個品種中卻是最大的，這表明該‘卷丹’在脅迫下比其它百合能更好地激活、運輸或轉錄基因，并調控抗逆響應蛋白。在三種同源基因可視化的RNA序列分析中，發現亞洲百合‘Tiny’的同源性比東方百合‘索邦’的同源性高很多(圖2)。Wang等(2015)結合生理試驗結果，進一步驗證了野生百合‘卷丹’和亞洲百合‘Tiny’具有更優異的抗逆性，通過這些轉錄組數據與生理和生化結果，推測出了野生百合‘卷丹’的基因調控和信號轉導通路。

3百合響應非生物脅迫的功能

蛋白研究蛋白質組學針對蛋白質的動態變化過程進行探究，揭示了植物細胞、組織或植物體蛋白質組成及其變化規律。蛋白質組學屬于功能基因組學，可以通過定性定量對研究對象進行檢測，得出研究對象的表達模式。差異蛋白質組學屬于蛋白質組學的一種，可以篩選對比經過不同處理后不同樣本的差異蛋白表達量，從而找出存在明顯差異的蛋白質(唐秀英等,2014)。在非生物脅迫條件下，百合體內的信號轉導因子和轉錄因子會影響基因的表達，進而產生差異蛋白并影響細胞膜的滲透調節作用與物質代謝活動。緊接著百合將通過自我修復和調控恢復正常的代謝功能。所以為了深入探索百合響應外界脅迫的信號轉導通路需要基于蛋白質組學的相關研究。在對百合進行高通量差異蛋白質組測序后，基于蛋白質數據庫搜索和檢測，對差異蛋白進行功能鑒定和分類分析，并且對不同差異蛋白與差異基因之間的關聯性進行驗證分析(王晶懋,2015)。研究表明，百合體內有三類功能蛋白可以響應外界非生物脅迫，其一具有減輕脅迫對細胞傷害的功能，如LEA蛋白、水通道蛋白、離子通道蛋白、滲透調節蛋白、抗凍蛋白等；其二是具有信號感應與信號轉導功能的蛋白激酶，如MAP激酶、CDP激酶、受體蛋白激酶、轉錄調控蛋白激酶、核糖體蛋白激酶等(張彬彬,2003)；其三是可以參與信號轉導且激活下游基因表達的轉錄因子，如MYB轉錄因子、WARY轉錄因子、DREB轉錄因子等。在‘卷丹’轉錄組COG(clusteroforthologousgro-ups)功能分析中，18736個基因通過在Swiss-Prot數據庫的搜索，得到了13705基因序列可以被COG注釋并分為25類(Huangetal.,2014)。在這25類之中：信號轉導機制(8332,17.54%)的轉錄物占比最多，接著是細胞骨架(7078,14.89%)；功能預測蛋白(4239,8.92%)；翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白(3865,8.13%)；RNA加工和修飾(3518,7.4%)；細胞內運輸、分泌和囊泡轉運(3333,7.01%)；轉錄因子(63223,3.78%)；防御機制(190,0.39%)和細胞外結構(147,0.30%)等類別(王晶懋,2015)。在該轉錄組COG分類中，有21.5%的基因被注釋到物質新陳代謝過程中，如碳水化合物、脂質、氨基酸和核酸的轉運與代謝。所以，當植物受到低溫脅迫時，基因表達量最多集中在物質代謝和信號轉導機制中，說明控制物質新陳代謝和信號轉導的基因在百合的冷應激中能夠產生積極的調節效應(黃潔,2014;劉曉華,2015)。對‘卷丹’中的差異蛋白進行研究后，發現在蛋白功能分類中，有35.1%的差異蛋白屬于物質代謝類；20.7%的差異蛋白屬于細胞救援、抵御和脅迫反應類；12.5%差異蛋白屬于能量類；10.1%的差異蛋白屬于信號轉導類；以上研究結果說明轉錄組測序的基因分類與鑒定蛋白功能分類是一致的。

4展望

百合響應非生物脅迫的分子機制比較復雜，通過轉錄組測序與蛋白質組學分子生物技術的介入，從分子生物學的角度對響應百合非生物脅迫的差異基因與差異蛋白進行解析與相關性分析。基于對野生‘卷丹’、東方百合‘Sorbonne’和亞洲百合‘Tiny’的GO、COG注釋和KEGG通路分析，需要進一步對響應脅迫的信號轉導注釋基因和物質能量代謝注釋基因進行深入研究。探索將來有必要對非生物脅迫下百合的響應非生物脅迫基因的表達與調控進行深入研究，進一步探索轉錄因子與上下游基因的關聯與信號轉導途徑，并對目標基因進行qRT-PCR表達量分析，差異基因與差異蛋白的相關性進行分析與驗證。對更多其他品種的百合非生物脅迫信號轉導通路的進行驗證。利用RACE技術，對轉錄組測序所得的更多的非生物脅迫基因片段進行全程克隆，獲得基因的全長cDNA序列。在此基礎上，建立百合轉基因體系，構建表達載體，采用轉基因技術、基因重組及表達等基因工程手段改良百合品種的抗逆性，可將轉錄因子導入擬南芥或煙草中進行基因超表達分析，對其他家族的轉錄因子與脅迫基因進行轉基因驗證，如DREB轉錄因子家族、MYB轉錄因子、WARY轉錄因子家族、MAP激酶、轉錄調控蛋白激酶、受體蛋白激酶，從而驗證這些基因的抗逆性，建立新的轉基因突變體系，進而培育出抗逆性強的百合新品種，為百合的育種、生產提供新的技術路徑與支持。

作者：楊陽1；王晶懋 單位：21西安工程大學服裝與藝術設計學院,2西安建筑科技大學建筑學院