天然蝦青素的抗疲勞研究范文

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《西南大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第三期

蝦青素（Astaxanthin），屬于酮式類胡蘿卜素，是一種萜烯類不飽和化合物，化學(xué)名稱為3，3－二羥基－4，4－二酮基－β，β－胡蘿卜素，分子式是：C40H52O4，具脂溶性，不溶于水，由于其具有不飽和酮基和羥基的共軛雙鍵鏈分子結(jié)構(gòu)，能提供吸引自由基的未配對(duì)電子，從而清除自由基，起到顯著的抗氧化功效．蝦青素最早是從蝦蟹的殼中分離提取獲得，20世紀(jì)80年代，蝦青素的生理活性功能被廣泛關(guān)注，在保護(hù)皮膚免受光損傷、預(yù)防動(dòng)脈硬化和相關(guān)疾病、抗癌活性、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、維護(hù)眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的健康、強(qiáng)化機(jī)體的能量代謝、抗感染活性等方面都表現(xiàn)出顯著的效果［4］．因此，蝦青素在高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健品、醫(yī)藥產(chǎn)品、化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域均有廣闊的市場(chǎng)前景．近年來，在抗疲勞的研究領(lǐng)域中，自由基與抗疲勞的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)，通過大量的動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)型疲勞的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激之間存在很大的關(guān)系．本實(shí)驗(yàn)以蝦類加工副產(chǎn)物為原料，提取蝦殼中的天然蝦青素，通過小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各項(xiàng)抗疲勞、抗氧化的指標(biāo)，探討天然蝦青素的抗疲勞和抗氧化活性，并分析二者之間的關(guān)系．

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：KM小鼠，雄性，體質(zhì)量為（20±2）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司．實(shí)驗(yàn)樣品：天然蝦青素凍干品，實(shí)驗(yàn)室自制．試劑：全血乳酸（BLA）測(cè)試盒、血清尿素氮（BUN）測(cè)試盒、糖原測(cè)試盒、葡萄糖測(cè)試盒、總抗氧化能力（T－AOC）測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（T－SOD）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）測(cè)試盒、一氧化氮（NO）測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；無(wú)水乙醇等均為市售分析純．

1．2實(shí)驗(yàn)儀器IVC型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備有限公司；BS124S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；5804R離心機(jī)，德國(guó)艾本德（eppendorf）公司；756P型紫外可見光分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司．

1．3實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1天然蝦青素樣品的制備［7］天然蝦青素樣品的制備采用文獻(xiàn)［6］的方法：蝦類加工副產(chǎn)物經(jīng)清洗、篩選、粉碎后，加入1moL／LHCL處理10h，用水洗至中性，置于50℃烘箱中干燥后，加入10倍質(zhì)量的95％乙醇；在60℃的溫度下，浸提3．5h，過濾得粗提液，反復(fù)提取2次；將粗提液混合，旋轉(zhuǎn)真空濃縮，在所得的濃縮液中加入1moL／L的HCL，調(diào)節(jié)pH值至pH＝2，置于冰箱冷藏室中；待蝦青素完全沉降，分離獲得蝦青素．由于蝦青素不易溶于水，實(shí)驗(yàn)前，將蝦青素置于4g／L的蔗糖酯水溶液中乳化均勻，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)．

1．3．2動(dòng)物分組與給藥分組方法將150只小鼠測(cè)體質(zhì)量后隨機(jī)分成5組，每組30只．設(shè)置為蒸餾水對(duì)照組、蔗糖酯水溶液對(duì)照組、蝦青素低劑量組（Ⅰ）、蝦青素中劑量組（Ⅱ）和蝦青素高劑量組（Ⅲ）．在福建省水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室的獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具內(nèi)飼養(yǎng)，設(shè)置籠內(nèi)環(huán)境溫度為25℃，相對(duì)濕度為55％，小鼠喂養(yǎng)普通飼料，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)1周后，進(jìn)行正式試驗(yàn)．給藥方法：蒸餾水對(duì)照組、蔗糖酯對(duì)照組、蝦青素低劑量組（Ⅰ）、蝦青素中劑量組（Ⅱ）和蝦青素高劑量組（Ⅲ），分別給予蒸餾水、4g／L的蔗糖酯水溶液、50，150，250mg／kg蝦青素蔗糖酯水溶液，每周測(cè)一次體質(zhì)量，以定量灌胃方式給藥，連續(xù)給藥30d后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)．

1．3．3力竭游泳時(shí)間及肝臟中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定從5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每組隨機(jī)抽取10只小鼠，在末次灌胃30min后，于尾部負(fù)5％體質(zhì)量的鉛絲，在水深不少于30cm、水溫為25℃的游泳箱中游泳，記錄小鼠力竭游泳時(shí)間（自游泳開始至沉入水面下8s不能浮出水面為止的時(shí)間）［7］．小鼠力竭游泳后，脊椎脫臼致死，立即取出肝臟，用冷藏后生理鹽水制備成一定濃度的肝組織勻漿．按試劑盒的方法測(cè)定T－AOC，T－SOD，MDA，GSH－Px，NO的濃度．

1．3．4抗疲勞指標(biāo)及血液中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定小鼠在末次灌胃30min后，眼眶靜脈處取血50μL，不負(fù)重將其置于水溫25℃的游泳箱中游泳20min，游泳后立即休息，30min后再次眼眶取血，采用試劑盒，分別測(cè)定BLA、BUN、葡萄糖、血液中抗氧化指標(biāo)T－AOC，T－SOD，GSH－Px，MDA，NO的濃度．取血后的老鼠脊椎脫臼致死，立即取出后腿肌肉和肝臟，按試劑盒的方法測(cè)定LG和MG的濃度．

1．3．5統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17．0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用方差分析．

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1天然蝦青素對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響小鼠連續(xù)灌胃給藥30d后，各蝦青素劑量組與對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0．05），都維持在40g左右（表1）．實(shí)驗(yàn)期間，各實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)不良反應(yīng)，體質(zhì)量正常增加，毛被正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明本實(shí)驗(yàn)制備的天然蝦青素?zé)o毒副作用，對(duì)小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)無(wú)顯著影響．

2．2天然蝦青素對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（表2），蒸餾水對(duì)照組與蔗糖酯對(duì)照組小鼠力竭游泳時(shí)間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明用來乳化蝦青素的蔗糖酯水溶液，對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間無(wú)明顯影響．天然蝦青素高劑量組（Ⅲ）小鼠力竭游泳時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)（120．29±13．16）min，比對(duì)照組提高了大約60％（p＜0．01）；但天然蝦青素低劑量組（Ⅰ）和中劑量組（Ⅱ）小鼠力竭游泳時(shí)間，相較對(duì)照組的增加幅度并不顯著（p＞0．05）．可見，天然蝦青素能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，具有一定的抗疲勞效果．

2．3天然蝦青素對(duì)小鼠全血乳酸（BLA）的影響持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，會(huì)引起機(jī)體內(nèi)全血乳酸（BLA）濃度的升高［8］．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（表3），與蒸餾水對(duì)照組相比，蔗糖酯對(duì)照組數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0．05），說明蔗糖酯對(duì)小鼠BLA指標(biāo)無(wú)明顯影響．天然蝦青素各劑量組的BLA濃度均有所下降，其中高劑量組（Ⅲ）下降幅度最大，游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠BLA濃度達(dá)（5．66±0．30）mmol／L，游泳運(yùn)動(dòng)30min后小鼠BLA濃度達(dá)（3．25±0．25）mmol／L，血乳酸曲線下面積達(dá)127．60，與蒸餾水對(duì)照組相比，分別降低了62．7％，24．1％，60．4％．說明，天然蝦青素可以降低小鼠運(yùn)動(dòng)后BLA濃度的增加幅度，從而延緩疲勞．

2．4天然蝦青素對(duì)小鼠血清尿素氮（BUN）濃度的影響對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)前后小鼠血清尿素氮（BUN）濃度進(jìn)行檢查．?dāng)?shù)據(jù)顯示（表4），蔗糖酯對(duì)小鼠BUN指標(biāo)無(wú)顯著影響（p＞0．05）．天然蝦青素各劑量組游泳前后的BUN濃度均有顯著降低，30min內(nèi)的清除率顯著提高，其中，中劑量組（Ⅱ）的清除率最大，為0．2053mmol／（L•min），比蒸餾水對(duì)照組提高了1．3倍．可見，天然蝦青素能快速降低小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)的BUN水平，減少機(jī)體內(nèi)的BUN濃度。

．5天然蝦青素對(duì)糖元的影響肝臟和肌肉是機(jī)體能量貯存的主要組織，糖元?jiǎng)t是直接的能源物質(zhì)［9］．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（表5），蔗糖酯對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖元（LG）和肌糖元（MG）的質(zhì)量比無(wú)顯著影響（p＞0．05）．天然蝦青素各劑量組小鼠的LG，MG含量較對(duì)照組均有顯著增加，增加幅度隨著劑量的增加而增大．其中，高劑量組小鼠游泳運(yùn)動(dòng)后30min內(nèi)LG和MG的回復(fù)率最大，分別為0．2797，0．0273mg／（g•min）．可見，天然蝦青素能增加小鼠體內(nèi)的糖元貯備量，并能顯著提高運(yùn)動(dòng)后小鼠糖元的回復(fù)速度。

2．6天然蝦青素對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血糖的影響血糖是肌肉可以直接利用的外源性糖的來源，也是肝糖元分解為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織的媒介物，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的必須物質(zhì)，因此，血糖下降是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲勞的主要表現(xiàn)［10］．對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)后的小鼠血糖進(jìn)行檢測(cè)（表6），數(shù)據(jù)表明，蔗糖酯對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠的血糖指標(biāo)沒有顯著影響．而天然蝦青素中、高劑量組的小鼠血糖有顯著提高（p＜0．05），均達(dá)6．0mol／L以上，較對(duì)照組均提高了約35％．可見，天然蝦青素能提高運(yùn)動(dòng)后小鼠的血糖含量，緩解運(yùn)動(dòng)后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲勞，增強(qiáng)抗疲勞能力．

2．7天然蝦青素對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟抗氧化水平的影響對(duì)小鼠游泳運(yùn)動(dòng)后的肝臟抗氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（表7），蔗糖酯對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠的各項(xiàng)肝臟抗氧化指標(biāo)無(wú)顯著影響（p＞0．05）．天然蝦青素各劑量組小鼠肝臟的總超氧化物歧化酶（T－SOD）、過氧化物酶（GSH－Px）和總抗氧化能力（T－AOC）活性指標(biāo)均有顯著提高，丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量顯著下降．可見，天然蝦青素能增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟中抗氧化酶T－AOC，T－SOD，GSH－Px的活性，抑制氧化代謝產(chǎn)物MDA及NO的產(chǎn)生，具有抗氧化作用．

2．8天然蝦青素對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血液抗氧化水平的影響對(duì)小鼠游泳運(yùn)動(dòng)后血液的抗氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（表8），蔗糖酯對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠的各項(xiàng)血液抗氧化指標(biāo)無(wú)顯著影響（p＞0．05）．天然蝦青素各劑量組小鼠血液的總超氧化物歧化酶（T－SOD）、過氧化物酶（GSH－Px）和總抗氧化能力（T－AOC）活性指標(biāo)均有顯著提高（p＜0．01），一氧化氮（NO）濃度顯著下降（p＜0．01），但丙二醛（MDA）濃度無(wú)顯著變化（p＞0．05）．可見，天然蝦青素能增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)后小鼠血液中抗氧化酶T－AOC，T－SOD，GSH－Px的活性，抑制氧化代謝產(chǎn)物NO的產(chǎn)生，起到抗氧化作用．

2．9天然蝦青素抗氧化與抗疲勞相關(guān)性的分析將各個(gè)劑量組小鼠血液中的總抗氧化能力（T－AOC）活性作為橫坐標(biāo)，分別以全血乳酸（BLA）濃度、血清尿素氮（BUN）濃度、肝糖元（LG）質(zhì)量比、肌糖元（MG）質(zhì)量比為縱坐標(biāo)作圖，可得到血液中總抗氧化能力T－AOC活性與BLA，BUN，LG，MG的相關(guān)性圖（圖1）．圖1（a），（b）分別為T－AOC活性與BLA濃度，T－AOC活性與BUN濃度的相關(guān)性圖，可知小鼠體內(nèi)T－AOC越強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的BLA，BUN量越少；圖1（c），（d）為T－AOC活性與LG質(zhì)量比，T－AOC活性與MG質(zhì)量比的相關(guān)性圖，可知小鼠體內(nèi)T－AOC越強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)后小鼠體內(nèi)LG，MG質(zhì)量比越高，即運(yùn)動(dòng)消耗的LG，MG越少．這表明小鼠體內(nèi)抗氧化功能越強(qiáng)時(shí)，抗疲勞功能也越強(qiáng)．另外，根據(jù)線性方程可以看出，總抗氧化能力對(duì)抗疲勞指標(biāo)的影響從大到小為L(zhǎng)G質(zhì)量比，BUN濃度，BLA濃度，MG質(zhì)量比．因此，當(dāng)抗氧化能力越高時(shí)，由于運(yùn)動(dòng)而引起小鼠產(chǎn)生的BLA和BUN量減少，對(duì)LG和MG消耗量也減少，從而提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，增強(qiáng)其抗疲勞能力．

3討論

抗疲勞作用包括延緩疲勞的產(chǎn)生和加速疲勞的消除兩個(gè)方面，常用的評(píng)價(jià)方法有兩個(gè)：運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)和生化指標(biāo)的檢測(cè)．運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，力竭游泳實(shí)驗(yàn)表明，蝦青素高劑量組能顯著延長(zhǎng)小鼠的力竭游泳時(shí)間，從而提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力．長(zhǎng)時(shí)間的劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體相對(duì)缺氧，需通過無(wú)氧酵解提供能量，產(chǎn)生大量的乳酸，從而影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生；同時(shí)，體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解也會(huì)隨之增加，最終產(chǎn)生尿素氮，使BUN水平升高，當(dāng)機(jī)體對(duì)負(fù)荷適應(yīng)能力越差，BUN的增加越明顯．蝦青素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)后的小鼠體內(nèi)BLA和BUN指標(biāo)的升高有顯著的抑制作用，可加快乳酸和BUN的清除速度，使機(jī)體快速恢復(fù)，從而提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力．體內(nèi)糖元與運(yùn)動(dòng)耐力密切相關(guān)，糖元儲(chǔ)備越多、合成越快，運(yùn)動(dòng)可持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蝦青素可提高小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖元的質(zhì)量比，提高糖元的儲(chǔ)備能力，加快糖元的回復(fù)速率，增強(qiáng)抗氧化能力．氧化應(yīng)激是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞的主要因素，當(dāng)運(yùn)動(dòng)激烈時(shí)，自由基產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致生物膜機(jī)能破壞，線粒體受到自由基攻擊，ATP供給量減少，肌肉工作能力減弱，產(chǎn)生疲勞感．在以有氧代謝為主的長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)過程中，MDA的升高反映了積累的自由基對(duì)組織細(xì)胞的損傷；總抗氧化能力T－AOC的降低反映了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)不足以對(duì)抗自由基的氧化作用；GSH－PX是清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的作用酶，其活力反映了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的活躍程度．天然蝦青素由于特殊的分子結(jié)構(gòu)，在清除自由基、降低過氧化物水平、強(qiáng)化機(jī)體抗氧化系統(tǒng)等方面功效顯著．結(jié)果表明，蝦青素能抑制運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟及血液中氧化代謝產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶T－AOC，T－SOD，GSH－Px的活性．說明，在劇烈運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激情況下，天然蝦青素具有對(duì)抗自由基產(chǎn)生并加速自由基的清除作用，顯示出卓越的抗氧化功效．并通過抗氧化與抗疲勞相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力的提高，使抗疲勞能力得以增強(qiáng)，兩者相輔相成．

作者：王茵 劉淑集 蘇永昌 胡婷婷 吳成業(yè) 單位：福建省水產(chǎn)研究所