發酵培養及增溶作用研究范文

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《中山大學學報》2015年第五期

VOCs因排放量大、種類多、毒性強已成為全球關注的焦點。目前已鑒定的VOCs達300多種，最常見的是苯、甲苯、二甲苯、三氯甲烷等。苯已被世界衛生組織列為強致癌物。VOCs處理方法很多，包括冷凝法、吸收法、吸附法和膜分離法、催化燃燒法、等離子體法、光催化氧化法及生物法等。目前應用較多是吸附法、催化燃燒法和生物法。前兩種方法成本高，給治理企業帶來了很大負擔。生物法操作簡單、成本低、無二次污染備受青睞。然而，由于VOCs水溶性差，導致其可生化性偏低，故限制了該技術的應用。

提高VOCs可生化性的重要途徑就是對其增溶。表面活性劑對VOCs具有良好的增溶作用。利用表面活性劑提高疏水性有機污染物的溶解性已有展開，但大多利用的是化學表面活性劑。而化學表面活性劑具有毒性且難降解，易引起二次污染。生物表面活性劑(簡稱BST)不僅具有良好的表面活性和乳化性能，且具無毒、易于生物降解等獨特優勢，使其在VOCs生物治理方面具有廣闊的應用前景。本研究針對VOCs水溶性差影響其生物降解問題，馴化VOCs增溶微生物，使其產BST。利用BST使VOCs增溶。本研究選擇苯和甲苯作為VOC的代表進行實驗。為了滿足實際工程的需要，直接用發酵液對VOC進行增溶，不僅降低生產成本，且發酵液完成增溶后還將為下一步降解微生物帶來營養。本研究建立一個完全開放式的自然發酵體系，可為BST的大批量生產提供技術支持。通過本研究，有望突破VOC因難溶于水而影響其生物降解這一瓶頸，為VOCs的高效生物處理提供科學依據。

1實驗材料

1.1主要儀器搖床(SUKUNSKY－211，上海蘇坤)、干燥箱(DHG－9240A，上海申賢)、電子天平(FA2204，上海安亭)、滅菌器(LS－B50L)、培養箱(SGSP－02黃石恒豐)、超凈臺(SW－CJ－1D，蘇州凈化)、水浴鍋(HH－4)、離心機(TDZ5－WS，長沙平凡)、pH計(DELTA320)、氣泵、流量計及液相色譜儀(日本島津)等。

1.2主要試劑苯(分析純，廣州化學試劑廠)、甲苯(分析純，廣州化學試劑廠)、蘇丹紅Ⅲ((分析純，廣州化學試劑廠)、甲醇(色譜純，廣州化學試劑廠)。

1.3培養基硫酸銨5g/L，廢石油20g/L，葡萄糖1.0g/L，氯化鉀1.0g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，pH7～7.5，自來水1L。

1.4種源樣品樣品來自某污水處理池。

2實驗方法

2.1增溶菌的馴化

2.1.1搖床馴化在無菌條件下，于500mL三角瓶中加入200mL滅菌培養基，污泥按一定比例接入，搖床馴化。

2.1.2擴大培養于2.5L用紗布封口的廣口瓶中加入1.5L發酵培養基，高壓滅菌。在無菌條件下，按一定比例轉接馴化種液，曝氣培養。按同樣方法，進行多次轉接。逐漸由無菌接種變為自然接種，再過渡到完全開放式自然培養。設對照組。

2.2增溶活性指標及測定方法

實驗時先用液態苯及液態甲苯進行驗證。

2.2.1增溶能力及測定方法取一直徑為9cm平皿，加入20mL去離子水，然后在水面上緩慢滴加2mL染色苯或染色甲苯，待形成穩定薄膜后，在薄膜中心滴加1mL離心后的發酵液。發酵液若能增加苯或染色甲苯在水中的“溶解”，便形成一圓圈，即增溶圈。測量增溶圈直徑。每組設3個平行，取其平均值。染色苯和染色甲苯是苯和甲苯分別用蘇丹紅Ⅲ染色而成的。

2.2.2乳化能力及測定方法苯或甲苯與發酵液按一定比例作用，若發酵液中有BST的產生，則二者即可形成乳化層。乳化能力以乳化百分率(EI)衡量。

2.3乳化液乳化性質的鑒別乳狀液兩類型［15］:一類是水包油型(O/W);另一類是油包水型(W/O)。為了提高鑒別的準確性，分別用親油性染料(蘇丹紅Ⅲ)和親水性染料(沙黃和結晶紫)對乳狀液進行染色。用蘇丹紅Ⅲ染色的乳狀液若整體為紅色，則為W/O型;若僅乳滴為紅色，則為W/O型。用沙黃或結晶紫染色的乳狀液若整體為紅色或紫色，則為O/W型;若僅乳滴為紅色或紫色，則為W/O型。

2.4增溶實驗

2.4.1增溶實驗方法實驗系統由氣泵、吸收瓶、氣體混合瓶、流量計及增溶瓶等通過膠管連接而成。增溶瓶有兩個。一個裝發酵液，為增溶實驗瓶;另一個裝空白培養基，為對照瓶。實驗所用苯及甲苯為氣態苯及甲苯。氣態苯及甲苯采用吹脫法配制。氣泵將空氣分別鼓入裝有液態二苯的吸收瓶和氣體混合瓶。通入吸收瓶中的空氣將氣態二苯載入混合瓶，與空氣按一定比例充分混合后分別被送入增溶瓶和對照瓶中。混合氣體的流量由流量計控制，保證通入增溶瓶的流量(16L/h)相等。連續6h后停止通氣，靜止6h，共持續12h，取樣，每1h取樣一次。

2.4.2增溶率的測定增溶率的測定采用高效液相色譜法測定“溶解”態苯的濃度。具體方法如下:(1)色譜條件。流動相甲醇水溶液，配比為V(甲醇)/V(水)=80/20，檢測器SPD－20AV、色譜柱SHIMADZUVP－ODSC18、流速0.8mL/min、柱溫40℃、檢測波長260nm。(2)增溶率(IS)的計算。增溶率(IS)為苯及甲苯在發酵液中的最大“溶解度”(Sf)與苯及甲苯在空白發酵培養基中的“溶解度”(Sc)之差與Sc的比值，為無量綱量。實驗所測得的溶解度為氣態苯及甲苯的表觀溶解度。因此，用表觀溶解度計算所得到的增溶率為表觀增溶率。實驗中用表觀增溶率來衡量發酵液中BST對氣態苯的增溶效果。通氣過程中定時測定發酵液對氣態苯及甲苯的“溶解量”及停止通氣后發酵液中苯及甲苯的溶解量。以時間為橫坐標，以發酵液中“溶解”態苯及甲苯的含量為縱坐標，繪制溶解量隨時間的變化曲線，確定發酵液對苯與甲苯的增溶穩定性。

3結果與分析

3.1搖床馴化結果

3.1.1葡萄糖質量濃度對馴化效果的影響設葡萄糖質量濃度為0、0.5、1.5和2.0g/L，其他條件不變，通過增溶能力和乳化能力，確定最佳葡萄糖質量濃度，結果見圖1。由圖1可知，當ρ(葡萄糖)為0g/L時，增溶直徑和乳化率都為0，說明發酵液沒有BST的產生。當ρ(葡萄糖)分別為0.5、1.5和2.0g/L時，發酵液都有BST的產生，但含量都偏低。當ρ(葡萄糖)為1.0g/L時，增溶直徑和乳化率都最大，即發酵液中BST含量最高。因此，發酵液最佳葡萄糖質量濃度確定為1.0g/L。以上結果表明，BST的產生需要一定糖類物質。廢石油是碳源，但不是唯一碳源，還需糖類碳源的幫助。廢石油起到的可能是刺激或誘導作用，在被微生物利用的同時，刺激其產BST。

3.1.3初始pH值對馴化效果的影響取葡萄糖質量濃度為1.0g/L，將初始pH值設為6.65、6.75、6.85、6.95、7.05、7.15、7.25和7.35，通過測定發酵液的增溶能力和乳化能力，確定最佳初始pH。結果見圖2。由圖2可知，初始pH值在6.95～7.05之間時，發酵液的增溶直徑和乳化率都相對比較高。高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。由此確定，發酵最佳初始pH值在6.95～7.05之間。

3.1.3溫度對馴化效果的影響在最適碳源濃度、最適初始pH值條件下，將搖床溫度分別設20、22、24、26、28、30、32、34和36℃，通過測定發酵液的增溶能力和乳化能力，確定其最佳馴化溫度。結果見圖3。由3可知，馴化溫度在26～32℃時，BST釋放量最大，高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。故確定發酵最佳溫度范圍為26～32℃。

3.2擴大培養結果

3.2.1BST產生規律通過測定發酵液對苯和甲苯的增溶活性，得到BST產生隨時間的變化規律(圖4)。由圖4可見，接種12h內，發酵液對苯和甲苯的增溶活性明顯增加。這說明增溶菌對新環境有較強的適應能力。自接種至36h，發酵液對兩種苯的增溶與乳化一直呈快速增加的趨勢，36h后緩慢下降。BST產生規律的研究對實際生產具有重要指導意義，可依據該規律，確定發酵周期。

3.2.2發酵液增溶效果(1)發酵液對苯的增溶效果。通過前面的實驗，已證明BST對液態苯及甲苯有優良的增溶及乳化能力，但實際生產時，被處理的VOCs成分為氣態形式。為了進一步證明BST對VOCs的增溶作用，即提高氣態苯類在水相中的“溶解度”，對其進行了增溶實驗。結果見圖5。由圖5可知，連續通氣1h后，苯在發酵液中的“溶解”量約為1.67g/L;苯在空白培養基的質量濃度只有0.7g/L。此后繼續通氣，兩種溶液中苯的含量都在增加。通氣4～6h，發酵液中苯的質量濃度基本穩定，達2.0g/L。6h后停止通氣時，空白培養基中苯的質量濃度僅為0.9g/L，而發酵液中苯的質量濃度一直在1.8g/L以上。在隨后的6h中，空白培養基中的苯一直在減少，平均揮發速率約為0.064g•L－1•h－1，而發酵液中苯的質量濃度維持在約2g/L。由此可見，在通氣過程中，發酵液對苯有明顯的“溶解”效果，且較穩定。發酵液的表觀溶解度達空白培養基的2.7倍。可見BST對氣態苯具有良好而穩定的增溶效果。(2)發酵液對甲苯的增溶效果(圖6)。從圖6可見，甲苯在純培養基中的表觀溶解度只有0.0047～0.0070g/L。但在發酵液中，甲苯的質量濃度在通氣開始時為0.11g/L，表觀增溶量是空白培養基的9倍。隨著甲苯氣體的持續通入，其在發酵液中的量不斷增加。通氣0～3h時，發酵液對甲苯的表觀增溶率達空白培養液的27倍。隨著時間的延長，空白培養基中的甲苯持續揮發，發酵液中甲苯含量比較穩定，說明BST能與甲苯穩定地結合在一起。在12h時，發酵液的表觀增溶量為空白培養基的30倍。可見發酵液對氣態甲苯也具有理想的增溶效果。

3.3乳化類型鑒定發酵液與苯和甲苯的乳化類型鑒定結果是:用蘇丹紅Ⅲ染色時，整體未被染色，染料與分散相不能互溶，而乳滴被染為紅色。初步判定乳化層為O/W型。用沙黃和結晶紫染色時，整體分別被染成了紅色和紫色，進一步證明乳化層為O/W型。水包油的“殼”外層親水，故可與水相混。本實驗中苯與BST所形成的乳滴為水包油，故易溶于水。這對苯類及其VOCs的生物降解是極為有利的。

3.4增溶菌的初步鑒定結果出于生產應用的考慮，本研究所馴化的增溶菌非單一純種。通過革蘭氏染色與顯微觀察，大都為革蘭氏陰性短桿菌。相關內容將進一步研究。

4結論

成功馴化獲得了產BST的微生物，確定了產BST的最適條件。BST具有明顯的產生規律，約36h時產生量最大。馴化所得到的BST對苯與甲苯都具有良好的增溶效果，發酵液對苯的表觀“溶解度”為空白培養基的2.7倍。在12h時，發酵液對甲苯的表觀增溶量為空白培養基的30倍。苯和甲苯與BST所形成的乳滴為水包油，易溶于水，這有利于苯類及其VOCs的生物降解。產BST的細菌大都是G－短桿菌。

作者：王國惠 許亞楠 單位：中山大學環境科學與工程學院