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《廣西植物雜志》2016年第10期
摘要:
以諾麗葉片為外植體，在添加不同激素種類和濃度的MS培養基上進行離體培養，建立兩種離體再生模式：模式Ⅰ為先脫分化愈傷組織，再分化不定根和不定芽，模式Ⅱ為直接培養生根后分化不定芽。結果表明：在模式Ⅰ中，誘導諾麗葉片產生愈傷組織的最優培養基為MS+0.1mg•L－16-BA+2.0mg•L－12,4-D；誘導葉片愈傷組織再分化出不定根和不定芽的最優培養基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA或MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA,其中MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間最早為10d左右，根系較發達，而MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間在15d左右，根系發達。在模式Ⅱ中，誘導葉片直接生根長芽的培養基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA。將模式Ⅰ和模式Ⅱ中，完成諾麗葉片離體再生的苗切下后接種到MS+0.2mg•L－1NAA培養基中誘導生根，15d左右分化出不定根，45d獲得完整植株。
關鍵詞:
諾麗；植物激素；愈傷組織；再生培養
諾麗又稱海濱木巴戟、海巴戟天、檄樹（吳田和藍增全，2011）、（曹艷花，2014）為茜草科（Rubiales）巴戟天屬(Morinda)植物（楊小波2013），是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木。主要生長于溫暖潮濕的熱帶、亞熱帶地區，在國外主要分布于南太平洋諸島，如大溪地、夏威夷、印度尼西亞等，在我國主要生長于海南島、西沙群島、云南西雙版納及臺灣南部等地區（何明霞和楊清，2006）。現代醫學研究證明,諾麗果汁中具有免疫調節及抗腫瘤作用的多糖成分（張學梅，2000）,果實單用或與其他植物合用可治療多種疾病,被醫學研究者稱為當代神奇的治療物質（賴茂良，2014）、（段文榮，2009）,有較高的經濟價值。早在2000多年前，波利尼亞人就用諾麗葉片治療疾病（張偉敏，2008），以及為服裝染色（白飛榮，2015）。諾麗鮮葉可以直接咀嚼，或者加水熬汁或浸泡飲用，也可曬干磨成粉末。在巴西諾麗葉被稱為“止痛草”，其對牙齦炎、牙周病、喉痛、感冒、頭疼、骨折、皮膚病等均有一定功效（楊焱，2009）。吳田（2011）以帶腋芽的莖段為外植體對諾麗進行離體培養，建立了高效的離體快速繁殖體系；謝江（2012）和潘曉晴（2014）分別以根和不帶腋芽的莖段為外植體，進行諾麗離體再生培養研究；而以諾麗葉片為外植體的離體培養研究還未見報道。無菌培養條件下，諾麗根較細，諾麗莖段較短，而諾麗葉片較大，作為外植體更容易獲得，因此，本文以諾麗無菌試管苗葉片為外植體，進行離體再生培養研究，以期為后續的遺傳轉化及基因改良研究奠定基礎。
1.材料與方法
1.1材料
實驗材料為西南林業大學園林學院組培室的諾麗無菌試管苗，取健康、無菌諾麗苗的葉片為外植體。試管苗每90d左右繼代一次，繼代培養基為MS+0.2mg•L－1NAA。
1.2培養基配制
以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA、NAA及2,4-D，共設計38種培養基（表1）；再加瓊脂0.6%、蔗糖3%，pH5.8，分裝，121℃滅菌20min。
1.3接種與培養
將諾麗無菌苗葉片，剪去葉尖和葉緣,剪成0.5cm×0.5cm方片,正面向上放于離體再生培養基上，確保其與培養基充分接觸。每瓶培養基中接種5塊葉片，每種培養基接種10瓶。接種后，將材料置于光照強度1500lx（12h/d）、溫度(28±2)℃的條件培養。培養過程中每5d觀察1次，統計培養物的形態、顏色和生長情況。以上實驗重復3次。
1.4離體再生苗生根
將長至2-4cm的諾麗葉片離體再生苗莖尖切下后，在MS+0.2mg•L－1NAA培養基上繼續誘導生根。觀察生根時間和過程，最終獲得完整植株。
1.5數據分析
愈傷組織誘導率(%)=產生愈傷組織的外植體數/成活的外植體數；不定根分化率（%）=不定根分化的外植體數/成活外植體數；不定芽分化率（%）=不定芽分化的外植體數/成活外植體數。實驗數據用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0統計軟件進行計算和方差分析，在方差分析的基礎上，用Duncan法進行多重比較分析。
2.結果分析
2.1先誘導脫分化愈傷組織，再誘導不定根和不定芽
2.1.1不同激素組合對葉片愈傷組織誘導影響
經方差分析可知，不同激素組合對葉片愈傷組織誘導存在一定影響（表2）。葉片在6-BA和2,4-D配合使用的培養基上，脫分化能力較好，可在20d左右形成嫩黃色接近透明的疏松的愈傷組織（圖1:A）。在6-BA濃度分別為2.0、3.0、4.0mg•L-1同時配合使用NAA的培養基上，在培養15d左右沿葉片主脈出現膨大，并逐漸形成愈傷組織。當6-BA濃度為2.0mg•L-1，NAA濃度分別為0.1、0.2、0.3mg•L-1時，葉片能誘導出黃白色顆粒，質地疏松的愈傷組織（圖1:B），但愈傷組織脫分化能力一般。當6-BA濃度為3.0mg•L-1,NAA濃度為0.1、0.2、0.3mg•L-1時，葉片能誘導出嫩綠色愈傷組織（圖1:C）。當NAA濃度高于0.3mg•L-1時，愈傷組織為黃褐色（圖1:D）。當6-BA濃度高于4.0mg•L-1時，愈傷組織為黃褐色且脫分化能力弱誘導率低。將誘導出的愈傷組織轉接至原培養基中繼續增殖繼代培養，每20d更換一次新鮮培養基，除6-BA和2,4-D配合使用的培養基，愈傷組織可在繼代培養基中不斷增殖，且愈傷組織質地更加疏松呈泥狀，黃色接近透明；其余在6-BA和NAA配合使用的培養基上繼代，愈傷組織增殖能力較弱，并逐漸褐化死亡。在6-BA濃度為0.1mg•L-1，2,4-D濃度為2.0mg•L-1時，愈傷組織脫分化能力最好，誘導的愈傷組織質地松散成泥狀、黃色接近透明，誘導20d、誘導率高達96.67%，并可不斷增殖繼代培養。因此，誘導諾麗葉片產生愈傷組織的最優培養基為MS+0.1mg•L－16-BA+2.0mg•L－12,4-D。
2.1.2不同激素組合對諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導影響
將諾麗葉片愈傷組織轉移至芽或根誘導培養基中（表3），發現單獨使用6-BA無任何不定芽或不定根分化，而配合使用了NAA的培養基，在6-BA濃度1.0mg•L-1至2.0mg•L-1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而升高；在6-BA濃度3.0mg•L-1至4.0mg•L-1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而減低。同時，在6-BA濃度1.0mg•L-1，NAA濃度0.4mg•L-1和6-BA濃度2.0mg•L-1，NAA濃度0.4mg•L-1時芽分化率最高達70.67%（P＞0.05差異不顯著）。通常在分化培養基培養10-15d左右，開始分化不定根（圖2:A），而后長出發達根系（圖2:B）；40d左右時分化出不定芽（圖2:C）。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導最佳培養基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA或MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA，兩種培養基之間不定芽分化率差異不顯著（P＞0.05），其中MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間為10d左右，根系較發達；而MS+2.0mg•L－16-BA+0.1mg•L－1NAA生根時間在15d左右，根系發達。
2.2直接誘導生根后誘導不定芽
葉片在6-BA濃度為1.0至2.0mg•L-1的培養基中培養10-15d，不定根沿葉片主脈處分化（圖3:A）,隨后長成發達根系（圖3:B）；培養50d左右分化出不定芽（圖3:C），最終完成離體再生（圖3:D）。其中6-BA濃度1.0mg•L-1、NAA濃度0.4mg•L-1時，芽和根的分化率分別為66.67%和74%。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，離體葉片再生最佳培養基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA。
2.3離體再生苗生根
將諾麗葉片完成離體再生的苗切下后接種到MS+0.2mg•L－1NAA培養基上繼續誘導生根，10d左右在切口處形成愈傷組織，15d后分化出不定根（圖4:A），30d左右分化出根系（圖4:B），45d后獲得再生苗完整植株（圖4:C）并分化出發達根系（圖4:D）。
3.結論與討論
3.1不同種類激素對葉片分化的影響
實驗以諾麗葉片為外植體，首次建立了諾麗葉片離體培養體系，并建立兩種不同的再生模式。對于葉片離體再生而言，外植體確定后，影響其再生率的最關鍵因素為激素。再生培養基中必須同時具有細胞分裂素類和生長素類物質（周瑞金和劉孟軍，2003），在不同生長素和細胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要（孫俊，2014）。本試驗中在MS培養基中單獨添加6-BA，葉片不能分化不定根和不定芽，在同時添加6-BA和NAA兩種激素后完成了葉片離體培養，說明諾麗葉片離體培養中這兩種激素配合使用效果較好與大多數木本植物的研究結果一致（Chen&Hsia,2006）。培養基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長能力和分化方向不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異（黃學林和李筱菊，1986）。
3.2不同種類生長素和濃度對葉片離體再生方式的影響
生長素的種類和濃度影響離體葉片分化不定芽的途徑，即是直接由葉片分化不定芽，還是先形成愈傷組織再分化不定芽（丁愛萍和王洪范，1996）。本試驗以諾麗葉片為外植體，建立了兩種離體再生模式（模式Ⅰ為先誘導愈傷組織后誘導不定根不定芽；模式Ⅱ為不通過愈傷組織直接誘導不定根后誘導不定芽）。諾麗葉片離體培養過程中，無論是哪種再生模式，愈傷組織、不定芽和不定根都是在主脈處形成，分析其原因，可能是雙子葉植物葉片主脈含有維管束，在維管束的木質部和韌皮部之間還存在形成層（李揚漢，1984）,形成層細胞可能具有較強的分生和再生能力（柴慈江，2011），所以促進了愈傷組織、不定根和不定芽的形成。歐陽超（2014）在橡膠葉片愈傷組織誘導的研究中發現，含主脈的葉塊其愈傷組織誘導率明顯高于不含主脈葉塊；Vieitez（1996）等研究指出，清水鋼葉片離體培養中，不定芽的形成主要在葉柄和主脈形成的愈傷組織上分化。本試驗中模式Ⅰ和模式Ⅱ的離體培養時間分別為65d和50d左右,兩種模式使用的誘導時間差異主要是由于模式Ⅰ誘導愈傷組織的時間在20d左右，模式Ⅱ利用諾麗葉片直接再生不定芽體系，未經愈傷組織，簡化了操作步驟，縮短了不定芽再生時間。
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作者:黃奧丹 藍增全 吳田 單位:西南林業大學環境科學與工程學院 西南林業大學園林學院