基因芯片技術(shù)在生物研究中的作用范文

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《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志》2014年第五期

1基因芯片制備

基因芯片的制備方法有2種:一種是原位合成法，是指將數(shù)量眾多的電極固定在固相支持物上，電極上具有生物親和性的多孔空間，用于合成DN段所需的4種單核苷酸可以進(jìn)入電極上的多孔空間，在電極上合成DN段，原位合成法又可分為光導(dǎo)原位合成法與原位噴印合成法;另一種是直接點(diǎn)樣法，是指將人工合成的寡核苷酸片段直接點(diǎn)在固相支持物上。原位合成法一般用于制備基因芯片，直接點(diǎn)樣法既可以用于制備基因芯片也可以用于制備蛋白質(zhì)芯片。

1．1光導(dǎo)原位合成法光導(dǎo)原位合成法是由美國昂飛公司研發(fā)的，利用光敏保護(hù)基將堿基單體的5''''端羥基保護(hù)起來，之后固相支持物上的光敏保護(hù)基與1個(gè)核苷酸單體連接，如此循環(huán)直到合成完成。光導(dǎo)原位合成法制備探針之間的距離為5～10μm，1cm2可以容納106個(gè)探針，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是步驟簡單、合成速度快且合成探針量大，缺點(diǎn)是合成的探針長度不是很長。

1．2原位噴印合成法噴印合成法原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成原理一致，形式類似于噴墨打印，有多個(gè)噴印頭及墨盒，墨盒里面裝有4種堿基的液體。噴印頭可以在整個(gè)載體上任意移動(dòng)，根據(jù)載體上不同位點(diǎn)探針的序列要求將特定的堿基噴印在特定的位置。

1．3直接點(diǎn)樣法目前很多公司都是使用直接點(diǎn)樣法生產(chǎn)基因芯片，這種方法可以根據(jù)使用者的要求生產(chǎn)出符合目的的相應(yīng)芯片。直接點(diǎn)樣是將合成好的探針、cDNA、基因組DN段通過人工或高速點(diǎn)樣器直接點(diǎn)在固相支持物上。根據(jù)點(diǎn)樣方式不同可將直接點(diǎn)樣法分為接觸點(diǎn)樣、非接觸點(diǎn)樣。對(duì)于直接點(diǎn)樣法來說，點(diǎn)樣器的好壞直接決定了基因芯片的探針密度及結(jié)合強(qiáng)度，點(diǎn)樣裝置質(zhì)量的衡量指標(biāo)有點(diǎn)樣速度、點(diǎn)樣穩(wěn)定性、點(diǎn)樣密度等。

2基因芯片在生物研究中的應(yīng)用

2．1基因表達(dá)分析通過基因芯片檢測(cè)生物不同發(fā)育階段或病原體不同致病階段的基因表達(dá)情況，可以研究基因的功能及病原的致病機(jī)理。Girke等運(yùn)用基因芯片對(duì)擬南芥種子發(fā)育過程進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)通過基因芯片篩選到的擬南芥2600個(gè)基因中，有25%的基因在種子中的表達(dá)量是葉子及根的2倍。沙門氏菌對(duì)家禽危害很大，可以引起家禽沙門氏菌病。Luan等制備了包含有13319個(gè)探針的雞基因芯片，在2周齡小雞感染沙門氏病菌前后，檢測(cè)到了588個(gè)差異表達(dá)基因，其中276個(gè)是已知功能基因，并且通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定驗(yàn)證了4個(gè)基因。Zhou等制備了水稻基因組表達(dá)芯片，經(jīng)過低能N+光束處理后，每30個(gè)與組蛋白相關(guān)的基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，每38個(gè)溴結(jié)構(gòu)域蛋白基因中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。Revel等運(yùn)用基因芯片對(duì)萊姆病原菌在不同培養(yǎng)條件下基因表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)把萊姆病原菌放在新環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，其基因表達(dá)情況會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生瞬變，并與新環(huán)境在很大程度上緩和，以適應(yīng)新環(huán)境，一旦適應(yīng)了新環(huán)境，萊姆病菌的基因表達(dá)情況趨于穩(wěn)定不變。病原微生物可以通過自身基因表達(dá)變化很快適應(yīng)新環(huán)境，這也是病原菌能快速產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。

2．2DNA測(cè)序DNA測(cè)序是指測(cè)定DNA分子中的核苷酸排列順序。基因芯片技術(shù)早期應(yīng)用于基因結(jié)構(gòu)及序列分析。利用基因芯片進(jìn)行DNA測(cè)序過程如下:將包含已知核酸探針的DNA芯片與待測(cè)的DNA樣品進(jìn)行分子雜交，在DNA芯片表面可檢測(cè)到熒光信號(hào)，通過分析形成的圖譜獲知樣品序列。對(duì)已知序列進(jìn)行重測(cè)序是DNA芯片的主要應(yīng)用之一，重測(cè)序指的是某種群或物種完成基因組測(cè)序后，對(duì)個(gè)體或群體的差異性分析，需要進(jìn)行再測(cè)序。由于序列已知，利用基因芯片技術(shù)開展重測(cè)序的效率大為提高。DNA芯片測(cè)序具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊，主要測(cè)序方法有SBH技術(shù)(sequen-cingbyhybridization)、CSH技術(shù)(con－tigousstackinghybrid-ization)。CSH技術(shù)測(cè)序的長度大于SBH測(cè)序的長度。目前基因表達(dá)譜芯片技術(shù)在檢測(cè)健康組織以及病害組織基因表達(dá)差異上得到了廣泛應(yīng)用，為揭示病害的發(fā)生機(jī)制以及尋找快速診斷防治方法提供了依據(jù)。在測(cè)定植物與病原物基因組突變等方面，基因芯片是強(qiáng)有力的工具。參照已知基因序列，在載體上合成大量寡核苷酸探針，與待測(cè)樣品進(jìn)行雜交，兩者匹配程度越高，雜交信號(hào)越強(qiáng)。基因芯片技術(shù)測(cè)序的準(zhǔn)確率較高，國外學(xué)者利用包含大量探針的微列陣對(duì)人類線粒體基因組的序列進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確率達(dá)99%。Hacia等用近5萬個(gè)核苷酸陣列對(duì)人、黑猩猩基因序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，二者同源性高，即進(jìn)化相似性強(qiáng)。

2．3發(fā)現(xiàn)新基因基因芯片技術(shù)為發(fā)現(xiàn)新基因提供了思路，基因組序列的發(fā)展為后基因組研究分析未知功能基因提供了參考。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法具有無法明確解釋生物生理過程中多基因之間的相互作用、序列信息不全、特異性不高等缺點(diǎn)。基因芯片技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法的不足，能獲得大量基因表達(dá)模式，分析其調(diào)控過程，并且從數(shù)以萬計(jì)的基因中尋找出差異表達(dá)基因。利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因在醫(yī)學(xué)上有極其重要的意義，尤其是致癌基因的發(fā)現(xiàn)。Yao等采用基因芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)了乳腺癌比較基因組雜交陣列，分析了與擴(kuò)增區(qū)域有關(guān)的每個(gè)基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)2個(gè)致癌新基因，分別為H2AFJ、EPS8。Wang等利用基因芯片篩選腫瘤細(xì)胞中耐藥性相關(guān)基因，通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)耐藥新基因，分別為c－Yes、c－Flip。Heller等利用基因芯片研究了腸炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(炎癥性)組織基因表達(dá)差異性，還發(fā)現(xiàn)了與炎癥有關(guān)的基因IL－3、Gro－A等。利用基因芯片技術(shù)，Misson等研究了擬南芥植物缺磷條件下的基因表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)了對(duì)磷缺乏起誘導(dǎo)、抑制作用的新基因，這為植物養(yǎng)分管理開拓了新的研究思路。Madsen等研究了溫度對(duì)肺炎球菌基因表達(dá)差異的影響，用基因芯片技術(shù)設(shè)計(jì)微列陣，分析其差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了91個(gè)未知功能新基因。研究人員利用基因芯片技術(shù)，篩選微生物誘導(dǎo)后的成年果蠅差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)未知功能的新基因。目前，松材線蟲已擴(kuò)散到我國南方多個(gè)省區(qū)，威脅我國許多重要旅游地區(qū)的生態(tài)安全，被認(rèn)為是一種毀滅性傳染病害。目前松材線蟲全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，利用基因芯片處理產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)，研究松材線蟲致病基因，對(duì)松材線蟲防治具有重要意義。

2．4病原檢測(cè)DNA芯片技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的檢測(cè)工具，在臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用。楊朋欣等通過弓形蟲、旋毛蟲的特異序列設(shè)計(jì)出特異性探針，建立了弓形蟲、旋毛蟲的液相基因芯片檢測(cè)方法。周鈞等利用日本血吸蟲基因芯片對(duì)江西省、湖南省的釘螺進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，江西省、湖南省感染性釘螺檢出率為100%。張錦海等根據(jù)瘧原蟲高度保守的基因片段制備了瘧原蟲診斷、分型基因芯片，能快速診斷出瘧原蟲及其分型，對(duì)瘧疾的防治具有重要意義。Tares等用同源DNA分別開發(fā)了松材線蟲特異性探針，可以將特異性探針固定到固相載體(如硅片、玻璃、塑料、尼龍膜等)上制成基因芯片，用于快速、精確檢測(cè)松材線蟲。

2．5繪制圖譜采用基因芯片探針陣列與相應(yīng)的生物信息方法可以進(jìn)行基因文庫作圖。張新建等用基因芯片技術(shù)研究了水稻白葉枯病菌的侵染過程，并分析其基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)侵染過程中有5個(gè)基因發(fā)生了明顯變化。趙寶存等采用基因芯片技術(shù)獲得小麥基因的差異表達(dá)圖譜，并分析了在不同鹽脅迫時(shí)間下小麥根部基因表達(dá)的變化，包括鹽誘導(dǎo)、鹽抑制表達(dá)基因。

3展望

基因芯片技術(shù)具有快速、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)林、畜牧、食品以及環(huán)境檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。但基因芯片技術(shù)仍然存在一些不足，主要表現(xiàn)在技術(shù)與設(shè)備方面。基因芯片技術(shù)在DNA測(cè)序、基因表達(dá)分析、發(fā)現(xiàn)新基因、繪制圖譜及病原檢測(cè)等方面有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

作者：邱秀文 吳小芹黃麟葉建仁單位：南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院/江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室