哺乳動物卵母細胞冷凍保存效果范文

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《基因組學與應用生物學雜志》2015年第四期

1卵丘細胞層對冷凍保存效果的影響

與卵母細胞相連的卵丘細胞是影響玻璃化冷凍效果的另一重要因素，關于卵丘細胞對卵母細胞冷凍效果的影響卻出現不同的研究結果。部分研究者猜測卵丘細胞層及其中的糖蛋白減緩了冷凍保護劑滲透速率，導致細胞內冷凍保護劑分布不均，從而未能達到冷凍保護作用(Mahmoudetal.,2010)。同時前人的研究也證實，水牛卵母細胞在冷凍前去除卵丘細胞，可起到很好的冷凍效果(Gasparrinietal.,2007)。卵丘細胞的去除增加MPF的活性、加速卵母細胞過渡到中期階段以及皮質顆粒的再分配(Zhouetal.,2010)。Bogliolo等(2007)報道，未成熟的綿羊卵母細胞玻璃化冷凍時，除去卵丘細胞層后，其存活率明顯高于帶有卵丘細胞層的卵母細胞，而進行體外成熟時發現兩組的紡錘體和染色體的正常分布率差異不大。但是當裸露的卵母細胞進行冷凍后，由于受精時缺少卵丘細胞，使得胚胎發育能力下降(Zhouetal.,2010)。體外成熟前或玻璃化冷凍前，卵丘細胞層的去除將對馬(Tharasanitetal.,2009)、鼠(Suoetal.,2009)和牛(Modinaetal.,2009)成熟或未成熟卵母細胞的形態均產生不利影響。小鼠未成熟卵母細胞進行玻璃化冷凍時必須保存包圍在其中的致密卵丘細胞層(Purohitetal.,2012)，附有卵丘層的牛卵母細胞發育能力高于裸卵細胞，馬卵母細胞體外成熟前或玻璃化冷凍前除去卵丘細胞層導致了減數分裂能力、紡錘體和染色質正常率下降(Tharasanitetal.,2009)。這可能與緊湊的卵丘細胞可阻止高毒冷凍保護劑的滲透以及在卵母細胞進行解凍時防止細胞內滲透壓的升高有關，使細胞的膨脹得以控制。

2卵母細胞發育階段對冷凍保存效果的影響

研究者進行了多次研究以確定適合卵母細胞玻璃化冷凍的最佳發階段，然而得到的結果是不確定的。卵母細胞成熟階段中的GV期(Wuetal.,2013)、GVBD期(Barnesetal.,1997)和M域期(Moetal.,2014)被認為是最有利進行玻璃化冷凍的階段。但也有一些研究與此相反，即減數分裂階段不影響冷凍保存后卵母細胞的發育能力(LeGalandMassip,1999;Hurttetal.,2000)。普遍認為，成熟的卵母細胞富含細胞器，如紡錘體和染色體，而這些細胞器對低溫極其敏感，冷凍易造成這些細胞器的損傷。GV期的卵母細胞核被膜包被，此外也無紡錘體的形成，理論上是進行冷凍的最佳時期，但是凍融后細胞的超微結構損傷嚴重，卵丘細胞層脫離，使得后續發育能力嚴重下降。在小鼠卵母細胞方面，Sehrleder等(1990)則發現了冷凍M域期的卵母細胞，凍融后細胞的形態正常率高達81%，2-細胞發育率為17%，比GV期卵母細胞具有更好的冷凍效果。此外，Mo等(2014)報道，在冷凍綿羊卵母細胞方面，與M域期卵母細胞相比，GV期卵母細胞對冷凍更為敏感。在水牛方面，Sharma和Loganathasamy(2007)報道，冷凍保存M域期卵母細胞，其后續發育潛能高于冷凍GV期的卵母細胞。凍融后發育潛能的降低主要歸因于卵母細胞自身的損傷，而受精失敗只是其中的一小部分原因。相比之下，Barnes等(1997)表明，卵母細胞在減數分裂的胚泡破裂階段進行冷凍保存，解凍復蘇后進行成熟培養，其后續胚胎的卵裂率和囊胚率高于GV期和M域期的。他們認為選擇中間階段的卵母細胞進行冷凍保存，可以規避一些與低溫保存相關的問題。Otoi等(1995)報道稱在慢速冷凍中成熟卵母細胞的抗凍能力比未成熟卵母細胞強，隨后在體外培養到達囊胚階段的概率大于卵母細胞在成熟早期階段的冷凍。然而，當添加了蔗糖作為冷凍保護劑，未成熟的卵母細胞冷凍保存后通過體外受精，卵裂率比凍融后M域期的高。這些結果表明，不同減數分裂階段卵母細胞冷凍保存效果的差異可能來自于冷凍保護劑類型的影響。

3冷凍保護劑的類型對冷凍保存效果的影響

細胞冷凍時添加冷凍保護劑可以促進細胞脫水，避免胞內冰晶的形成，更高程度提高卵母細胞凍融后的存活率。當哺乳動物細胞處于普通鹽溶液進行冷凍時，細胞將不可避免的受到損壞。然而，研究者偶然發現，當家禽精子處于10%甘油和白蛋白所組成的溶液時，凍融后精子仍存活，使用凍融后的精子進行人工受精，可以產生后代(Polge,1952;Schieweetal.,1991)，這是第一個詳細報道了哺乳動物細胞經過冷凍保護劑的處理后，可以成功進行冷凍保存。自從首次發現以來，研究人員通過不斷的試驗，發現許多低分子量保護劑使細胞免受冷凍傷害，這些化合物統稱為冷凍保護劑。目前，冷凍保護劑分為兩大類：膜滲透性冷凍保護劑(乙二醇,二甲基亞砜,丙二醇)和膜非滲透性冷凍保護劑(蔗糖,聚蔗糖,葡萄糖,蛋白質類,脂蛋白)。膜滲透性冷凍保護劑通過以下幾種機制起作用：降低溶液的冰點，防止過高的電解質濃度對卵母細胞的傷害；與膜相互作用，冷凍時在細胞膜表面形成一層玻璃樣狀；替代細胞內的水份，防止胞內冰晶的形成(Polge,1952)。慢速冷凍所需要的冷凍保護劑濃度在1~1.5mol/L之間，毒性較小，但玻璃化冷凍要求較高的冷凍保護劑濃度(高達8mol/L)，而EG和DMSO因其分子量較小而常被作為滲透性保護劑(Somfaietal.,2013)。膜非滲透性冷凍保護劑通過增加溶質的濃度產生跨細胞膜滲透梯度，作為細胞外液抗凍保護劑，不能滲透到細胞內部。將糖類添加到玻璃化冷凍液可以提高溶液粘度，即細胞在冷凍前用含有糖類的冷凍保護液進行處理，有利于細胞內水分的滲出，同時減少細胞在保護劑的暴露時間，降低細胞毒性(iefetal.,2005)，并且一些膜非滲透性冷的保護劑在細胞冷凍期間能夠穩定細胞膜。通過使用兩種或兩種以上不同種類的混合物或多步平衡(兩步或兩步以上)可減少溶質損傷。目前，研究者常聯合使用兩種類型的冷凍保護劑進行卵母細胞的冷凍保存。據報道，相比于使用單一的冷凍保護劑，兩種以上的混合物冷凍保護劑更有利于卵母細胞的冷凍保存(Chianetal.,2004;Guptaetal.,2007)。二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇和甘油通過不同的組合常用于哺乳動物卵母細胞和胚胎的玻璃化冷凍中(Moussaetal.,2014)。幾項研究表明，EG是理想的冷凍保護劑，因為它滲透入膜的速度快于其它冷凍保護劑，從而降低了對細胞的毒性(Somfaietal.,2014)。在實際操作中，應當根據物種類型，選擇最佳保護劑組合和作用濃度，將其不利影響最小化。

4冷凍保護劑的暴露時間對冷凍保存效果的影響

玻璃化冷凍所需冷凍保護劑的濃度很高，很容易對細胞產生毒性(Sanchez-Partidaetal.,2011)。因此，不同種類冷凍保護劑的濃度和暴露時間對凍融后卵母細胞的存活至關重要。目前有兩種方法可將這些不良影響降到最低：一是在置于低濃度的冷凍保護劑溶液平衡之前，使卵母細胞短暫接觸含有高濃度冷凍保護劑的玻璃化溶液；二是在確保冷凍保護液滲入細胞時，盡可能縮短曝露于冷凍液的時間(Konoetal.,1991;Woodetal.,1993)。暴露于冷凍保護劑的時間主要取決于它們滲透到卵母細胞或胚胎的速度，如EG由于分子量小，滲透率比甘油、DMSO和PG高。Mahmoud等(2010)報道稱將卵母細胞分別暴露于二甲亞砜、乙二醇和甘油中，隨后通過形態學檢查顯示，未成熟的水牛卵母細胞的存活率并沒有差異。在這方面，Wood等(1993)也報道了小鼠和倉鼠的卵母細胞暴露在1.5mol/LDMSO3~5min，復蘇后大部分形態恢復正常。但在這實驗中，水牛卵母細胞成熟率卻嚴重受到影響，其中在DMSO組最嚴重，其次是甘油和EG組。Martins等(2005)報道，牛未成熟的卵母細胞在40%的EG中平衡時間長達5~15min，嚴重降低了卵母細胞的成熟率。這表明在選擇不同種類的冷凍保護劑時，暴露時間是一個非常重要的參數，最佳暴露時間可降低細胞毒性以及防止胞內冰晶的形成。

5冷凍載體的類型對冷凍保存效果的影響

1995年，Han等(1995)研究結果表明載體所盛的溶液體積與冷凍速度密切相關，減少載體所帶的液體，能提高冷凍降溫速度。體內外生產的胚胎和卵母細胞進行玻璃化冷凍時使用合適的冷凍載體進行冷凍保存，能加快冷凍與解凍速率，提高冷凍保存效率。迄今為止，使用冷凍帽法(cryotop)、開放式拉長塑料塑管法(pulledstraw,OPS)、冷凍環法(cryoloop)、玻璃微細管法(glassmicropipette,GMP)、金屬表面積法(solid-surfacevitrification,SSV)等冷凍載體保存人、山羊、牛、鼠及馬的卵母細胞或胚胎時均有獲得成功的報道。近十余年來，卵母細胞的玻璃化冷凍中，OPS和Cryotop方法常被廣泛使用(Jim佴nez-Trigosetal.,2013;Alietal.,2014)。在卵母細胞和胚胎的玻璃化冷凍中，合適的冷凍載體能夠使細胞快速越過危險溫區，降低冷凍損傷程度。Subramaniam等(1990)研究表明，解凍時將冷凍管在空氣停留幾秒對于防止透明帶斷裂至關重要的。但是Cetin和Bastan(2006)研究發現將冷凍管在空氣中停留5s，透明帶依舊有破裂的現象，這可能是由冷凍載體在解凍時影響到解凍速率，未能越過冰晶的臨界溫度。此外，Lim等(1991)研究觀察到卵母細胞玻璃化冷凍后的存活率會因為冷凍載體的不同而出現差異，所以推測可通過對冷凍載體進行改善而獲得更好的冷凍效果。為了提高玻璃化的冷凍與解凍速度，有必要通過選擇更合適的冷凍載體盡可能減少所帶玻璃化溶液的體積，提高冷凍保存的效果。

6結語

低溫生物學因其在胚胎生物技術和輔助生殖技術方面有著廣闊的應用前景，受到了極大的關注。目前，玻璃化冷凍技術已廣泛應用于多種哺乳動物卵母細胞的冷凍保存，然而由于卵母細胞自身的特點，造成玻璃化冷凍技術的應用存在許多問題，主要表現為凍融后細胞結構的改變和后續發育能力降低。影響卵母細胞玻璃化冷凍效果的因素是多方面的，很難由一方面的改進而使冷凍效果發生較大的變化。近年來平衡時間的優化、加快降溫速率和解凍程序的改善也成了研究卵母細胞冷凍的關注點，而具體的效果有待在研究中不斷的摸索。因此，在卵母細胞玻璃化冷凍技術的改良上，還需要進行多方面的研究。

作者：王彩玲張華智王利彭三鳳周學亮陸陽清楊小淦許惠艷盧晟盛盧克煥單位：廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室 廣西高校動物繁殖與動物生物技術重點實驗室欽州市畜牧站,