真菌毒素的分析范文

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《糧食與飼料工業雜志》2016年第6期

摘要：

真菌毒素是某些真菌在生長過程中產生的有毒次級代謝產物，它們的種類繁多，玉米在生長及貯藏過程中經常會受到它們的感染；一定條件下，它們會和糖類或其他基質結合形成結合態形式，被稱為隱蔽型真菌毒素，隱蔽型真菌毒素是當前研究的熱點。闡述了玉米中常見的真菌毒素，例如：嘔吐毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、T－2和HT－2等的毒理學性質和檢測方法，著重介紹了其隱蔽型毒素的形成、結構、毒理學性質和檢測方法，旨在為今后的研究提供參考。

關鍵詞：

玉米；真菌毒素；隱蔽型真菌毒素；毒理學性質；檢測方法

真菌毒素一詞來源于希臘語，是希臘語中的（真菌）和（毒物）的結合［1］，目前已知的真菌毒素有300多種，主要影響玉米質量安全的菌種有嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬菌素、T－2毒素和HT－2毒素以及它們的隱蔽型真菌毒素。真菌產生真菌毒素是自身的一種防御機制和／或有助于在宿主體內定植，所以真菌毒素是有毒的二級代謝產物。由于玉米的質量安全直接影響人畜的健康，這幾種真菌毒素特別是其隱蔽型毒素的形成、結構、毒理學性質和檢測方法成為國內外的研究者們探究的熱點問題。概述了玉米中這幾種常見的真菌毒素種類、性質和國內外主要的研究方法，介紹了其隱蔽型真菌毒素的形成、結構、毒理學性質和檢測方法，旨在為今后的研究提供參考。

1玉米被真菌毒素污染的情況

我國是飼料生產第一大國，養殖業發展的興衰與飼料質量安全息息相關，玉米被人們公認為“飼料之王”。玉米含有多種人體所必需的氨基酸［2］、黃體素、玉米黃質［3］以及谷固醇、卵磷脂、維生素等［4］，有美容、明目和預防高血壓和冠心病等功效。隨著人們生活水平的提高和畜牧業的發展，玉米起著十分重要的作用。但是玉米的安全涉及各種微生物次級代謝產生的毒素，直接關系到人類健康。據FAO統計，約有25％的糧食產品受到真菌毒素的污染［5］，平均有2％的糧食因為霉變而不能食用，至于真菌毒素對人畜產生的危害還無法估計。馬皎潔等［6］于2010年在安徽、云南、福建、甘肅、廣西、海南、黑龍江、湖北、湖南、江西、山西和上海等12個省（市／自治區）采集玉米及其制品、小麥粉、大米和花生共計650份樣品，進行真菌毒素的檢測，結果表明，215份玉米樣品中有84．65％檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其中7份樣品中的DON污染水平超過我國規定的1000μg／kg限量標準，超標1．08～2．51倍（平均1．77倍）；69．30％的玉米樣品玉米赤霉烯酮呈陽性，其中23份樣品中的ZEN水平超過我國規定的60μg／kg限量標準，超標1．06～19．19倍，平均4．32倍；53．02％的玉米樣品還受到黃曲霉毒素的污染，其中有12份樣品中的黃曲霉毒素B1（AFB1）含量超過了我國規定的20μg／kg限量標準，尤以云南、廣西等地樣品受污染較重。

2真菌毒素及其隱蔽型的種類及性質

玉米在生長、貯藏過程中，經常會受到黃曲霉毒素、伏馬菌素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T－2和HT－2等毒素的污染。

2．1黃曲霉毒素黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等產生的次生代謝物［7］，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中AFB1在玉米、花生、堅果、大米和植物油等食品中均有分布，而且玉米被認為是受AFB1污染較為嚴重的農作物。AFB1不僅分布最為廣泛，也是對人類健康危害最大的毒素之一［8－9］。由于具有較高的致癌性，世界各國對食品中的AFB1限量做出了嚴格規定。歐盟在98／53／EC指令中規定，人類直接食用的花生中AFB1的限量是2μg／kg。我國對食品中黃曲霉毒素等重要毒素規定了最高限量標準［10－14］，在各類食品中AFB1的限量為0．5～20μg／kg［10］。

2．2伏馬菌素及其隱蔽型伏馬菌素是一組水溶性的霉菌毒素，主要由串珠鐮孢菌、輪狀鐮孢菌、多育鐮孢菌和其他一些鐮孢菌產生［15］。常見的種類有FB1、FB2、FB3。因為處于生長期、儲存期的農作物會經常受到串珠鐮刀菌的污染，它廣泛存在于亞洲、美洲、歐洲等北溫帶地區的谷物中，尤其是玉米污染最為嚴重。伏馬菌素對人畜有很強的毒副作用，例如：馬的腦白質軟化癥、豬的肺水腫等，中國、非洲的食道癌的高發生率和它也有一定的關系［16］。當前的研究熱點主要在伏馬菌素的隱蔽型上：［17］。有研究表明，是伏馬菌素和還原糖熱反應的產物，它的反應過程類似于在非酶褐變的過程中氨基酸和還原糖的反應。而在熱的水溶液中和還原糖反應的初始產物經過Amadori重排列形成β－氨基酮，β－氨基酮被氧化形成［18］。伏馬菌素的毒素反應主要是由伏馬菌素結構上的氨基酸組導致的［19］，當氨基酸和還原糖偶聯后，形成的伏馬菌素衍生物會降低原伏馬菌素的毒素程度［20］；但是在消化過程中，氨基酸組可能又會被釋放出來。所以研究伏馬菌素的隱蔽型對人畜的安全是非常重要的。

2．3嘔吐毒素及其隱蔽型嘔吐毒素（vomitoxin）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，縮寫為DON，它主要由鐮刀菌屬產生，它的危害主要表現為導致人畜的飲食量下降、嘔吐、生長緩慢、抵抗力下降等［21］。在中國和印度，曾發生過因為食用了含有大劑量嘔吐毒素的加工食品，而引起腸胃疾病等病例［22］。Collins等［23］認為，當DON的攝入量為5mg／（kg·d）時，會導致骨骼的異常生長而致畸型。它的隱蔽形式主要有：Deoxynivalenol－3－glucoside（D3G）、Deoxynivalenol－3－glucoside（3－ADON）、15－acetyl－deoxynivalenol（15－ADON）、Ni－valenol（NIV）和Fusarenon－X（FUS－X）。Ma－sayo［24］和Berthiller［25］研究表明，D3G廣泛存在于自然生長的谷物中和被鐮刀菌素感染的植物中，DON通過由植物酶催化的糖基化轉化為D3G，它的毒理學作用和DON一樣，都會影響蛋白質的生物合成。Jecfa［26］在2011年強調，D3G在哺乳動物的消化過程中，可能被乳酸菌所水解。雖然現在還不知道D3G在消化過程中是否能夠重新裂解為嘔吐毒素，但是依然會認為它對人類和動物的安全有潛在的危害［27］。3－ADON、15－ADON、NIV和FUS－X是嘔吐毒素的乙酰基衍生物，Eriksn認為3－ADON和15－ADON的毒理學作用比DON還要高，對人畜的健康影響更大。Nathan［28］認為，植物在降解DON毒性時，會通過3－O－乙酰轉移酶把DON變成3－ADON，而這個過程植物不能自己控制。雖然DON和ADON在化學結構上非常相似，但是當前對其轉化方式的研究還很薄弱，在研究食品加工過程時，嘔吐毒素的隱蔽型毒素對人畜的危害程度是當前研究的熱點問題。

2．4玉米赤霉烯酮及其隱蔽型玉米赤霉烯酮又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產生的有毒代謝產物。它主要污染玉米、麥類、谷物等，而且在世界各地各種糧谷與飼料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發生雌激素亢進癥，導致動物不孕或流產，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業帶來很大的經濟損失［29］。α－赤霉烯醇和β－赤霉烯醇是玉米赤霉烯酮的生物轉化形式，它們是由ZEN分子上的葡萄糖醛酸轉化為葡糖苷酸而形成的［30］，也可以由鐮刀菌自然生成。最近調查顯示，它們能干擾多種酶參與類固醇的代謝［31］，有研究表明，在受污染的谷物中，它們比ZEN的存在率更高。α－赤霉烯醇的雌性激素的活性比ZEN還要高的，因此，研究α－赤霉烯醇和β－赤霉烯醇對農業經濟及人畜的健康影響是非常重要的［32］。除了α－赤霉烯醇和β－赤霉烯醇，ZEN還會和葡萄糖苷形成ZEN－14－β，D－glucoside結合態，而且在擬南芥中，α－赤霉烯醇和β－赤霉烯醇也能和葡萄糖苷形成α，β－ZEL－14－β，D－glucosides。除了以上的ZEN結合態［33］。最近研究的熱點還有ZEN－14－sulfate，它首先被Plasencia和Mirocha從接種禾谷鐮刀菌的水稻中分離出來［32］，雖然在酸性條件下部分硫酸鹽鍵很容易被斷開，但是這個結合態最能保持原ZEN的生物活性，因此，最近幾年在檢測游離或隱蔽的ZEN時，經常會檢測ZEN－14－sulfate的含量［34－35］。目前，有很多學者對以上這些ZEN結合態做了大量的研究，但是對于它們檢測方法的研究還非常欠缺。

2．5T－2和HT－2及其隱蔽型T－2毒素（T－2）是鐮刀菌屬霉菌在一定條件下產生的一組倍半萜烯類化合物，主要會危害動物的造血組織和免疫器官，引起動物的出血性綜合征，會出現白細胞減少、貧血等癥狀，還會使胃腸道功能受損等［36－37］。3’－hydroxy－T－2和3’－hydroxy－HT－2toxins是T－2和HT－2毒素的氧化形式［38］。T－2毒素的異戊酰基的羥基化以及它的代謝是T－2毒素解毒的主要途徑。在一些牲畜中，例如豬中CYP3As能夠把T－2毒素轉化成它的羥基化的形式，但是在雞中CYP3As不能把把T－2毒素轉化成它的羥基化的形式。對于這個方面，專家們經過進一步的調查研究得到P450能夠把T－2toxin轉化成3’－OH－T－2。關于它的解毒途徑還需要進一步研究。

3國內外研究現狀

國內外對真菌毒素的研究方法主要有酶聯免疫吸附法、膠體金免疫吸附法、薄層色譜法、近紅外光譜法、氣相色譜法及氣相色譜－質譜聯用法、液相色譜及液相色譜－質譜聯用法。

3．1黃曲霉毒素的檢測國內外檢測AFB1的方法有很多，例如薄層色譜法、半定量薄層色譜法、雙向薄層色譜法、酶聯免疫吸附法、免疫親和熒光光度法、膠體金法。其中薄層色譜法是最常用的檢測AFB1的方法，原理為AFB1經提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm下產生藍紫色熒光，根據其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來確定其含量［39］。國標中能同時檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法主要有免疫親和柱凈化－高效液相色譜法，它的原理為，試樣采用甲醇溶液提取，過濾、稀釋得濾液，濾液經含有黃曲霉毒素特異性抗體的免疫親和層析柱層析凈化，高效液相色譜儀分離，熒光檢測器柱后光化學衍生來確定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。該方法AFB1檢出限為0．2μg／kg，AFB2檢出限為0．2μg／kg，AFG1檢出限為0．3μg／kg，AFG2檢出限為0．3μg／kg；AFB1定量限為1．0μg／kg，AFB2定量限為1．0μg／kg，AFG1定量限為1．0μg／kg，AFG2定量限為1．0μg／kg［40］。

3．2伏馬菌素的檢測關于伏馬菌素的檢測國內外已建立了多種方法，例如薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜－質譜聯用法、酶免疫法和膠體金免疫技術等。Preis等［41］在2000年應用免疫親和柱凈化、TLC／光密度法檢測出了玉米中的FB1，該方法檢出限為0．1mg／kg，平均回收率＞85％，變異系數≤19％。根據AOAC995．15（FumonisinsB1、B2、B3incornLiquidchromatographicmethod），通過液相色譜法可以同時測定玉米中的FB1、FB2、FB3含量。原理為，經乙腈水溶液提取的提取液經固相萃取小柱凈化，然后用乙酸－甲醇溶液將毒素洗滌出來，鄰苯二醛被加入到洗滌溶液中，形成伏馬菌素熒光衍生物，從而被液相色譜檢測出來。2002年，Stephen采用LC－MS檢測到了隱蔽型毒素N－（carboxym－ethyl）fumonisinB1和N－（1－deoxy－D－fructos－1－yl）fumonisinB1的存在［16］。

3．3玉米赤霉烯酮的檢測玉米赤霉烯酮檢測的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、免疫親和柱－熒光檢測法和酶聯免疫法。國際上，玉米中的玉米赤霉烯酮主要是通過薄層色譜法檢測的；而國標是通過免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定的。其原理為，先用提取液提取試樣中的玉米赤霉烯酮，經免疫親和柱凈化，然后用高效液相色譜熒光檢測器測定，外標法定量。該方法糧食和糧食制品的檢出限為20μg／kg，酒類的檢出限為20μg／kg，醬油、醋、醬及醬制品的檢出限為50μg／kg［42］。對于它的隱蔽型毒素α－赤霉烯醇和β－赤霉烯醇，王瑞國等［43］采用液相色譜－串聯質譜法進行了測定，結果表明，該方法α－赤霉烯醇回收率在78．3％～98．3％，β－赤霉烯醇的回收率在74．1％～94．8％。當前α，β－ZEL－14－β、D－glucosides和ZEN－14－sulfate的檢測方法研究的比較少。

3．4嘔吐毒素的檢測國內外對于嘔吐毒素的檢測方法有很多，例如酶聯免疫法、液相色譜法、薄層色譜法。國標關于谷物中的嘔吐毒素（DON）的檢測方法有薄層色譜法和免疫吸附法。薄層色譜法的原理為，谷物及其制品中的DON經提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層展開后，加熱薄層板，由于在制備薄層板時加入了三氧化鋁，使DON在365nm紫外燈下顯藍色熒光，然后與標準比較，該方法的檢出限是0．1mg／kg［44］。至于它的隱蔽型毒素，國內外的學者研究的比較多，一般都是應用液質聯用的辦法檢測它們。孫娟等［45］采用超高效液相色譜串聯質譜法對3－ADON、15－ADON進行了檢測，3－ADON和15－ADON的檢出限都是1μg／kg，定量限為3μg／kg。

3．5T－2和HT－2毒素的檢測國內外對于T－2毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附分析技術、高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜－串聯質譜法和氣相色譜及其聯用技術。根據國標介紹，T－2毒素和HT－2毒素的測定是用薄層色譜法，原理為，配合飼料中的T－2毒素經提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層板展開后，用質量分數20％的硫酸乙醇噴布，加熱薄層板，使T－2毒素在365nm紫外光燈下顯藍色熒光，根據其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量來測定含量，此方法的檢出限為1mg／kg［46］。2009年牟仁祥等［47］應用免疫親和柱凈化－液相色譜質譜法對糧谷中的T－2和HT－2毒素進行了測定，這兩種毒素的平均回收率為76％～90％，T－2和HT－2毒素的檢出限（S／N＝3）分別為0．001、0．002mg／kg。

3．6多種毒素的同時檢測因為玉米經常同時感染多種真菌毒素，所以應用一種檢測方法檢測單一的真菌毒素比較耗時。國內外經常應用HPLC－MS／MS同時檢測谷物中的多種真菌毒素。在液質聯用技術中，高效液相色譜與質譜優勢互補，能將色譜分離效果好的優點與質譜靈敏度高、選擇性好的優點結合起來，高靈敏度同步檢測出玉米感染的多種真菌毒素。我國出口的花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素B1、嘔吐毒素、T－2和HT－2，可采用液相色譜串聯質譜法同時檢測［48］。

4總結與思考

玉米是飼料的核心原料，它的質量直接影響飼料的安全，飼料的安全性間接影響人畜的安全，但是玉米在生長過程中很容易受到真菌毒素的感染。研究玉米感染的真菌毒素對我國的食品安全具有重要的意義。至今為止國內外的學者們對真菌毒素的研究主要存在以下3個問題：

（1）對一些毒素的隱蔽態形式的檢測方法的研究還很缺乏，例如N－（carboxymethyl）fumonisinB1、N－（1－deoxy－D－fructos－1－yl）fumonisinB1、α，β－ZEL－14－β、ZEN14S、NIV和FUS－X等，而且這些隱蔽毒素的標準品在國內外還很難買到，這導致對它們的檢測有很大的困難。

（2）隱蔽型真菌毒素在人畜體內是否能夠還原成原來的毒素，是否仍然還會對人畜的健康造成危害，還需要國內外的學者們繼續深入研究。

（3）在同時檢測多種真菌毒素時，應用液質聯用技術雖然檢測效率高、靈敏度強，但是由于不同真菌毒素的理化性質不同，提取凈化時會使一些毒素流失，使同時檢測多種真菌毒素的回收率沒有單一檢測時的高。針對以上的問題，建議采取以下措施：

（1）在深入了解隱蔽型真菌毒素的轉化機制后，探索它們在液相色譜中的出峰時間，從而應用制備液相來進行制備，并進一步純化得到隱蔽型真菌毒素的標準品。

（2）在探究隱蔽型真菌毒素在人畜體內是否還仍然對健康產生危害時，可以應用小鼠實驗來進行探索。

（3）在同時提取凈化多種真菌毒素時，不要單一使用一種提取液去進行多種真菌毒素的提取，而且親和柱專一性很強的凈化方式也不適合多種真菌毒素同時凈化。雖然在對真菌毒素隱蔽型的研究及毒素同時檢測方法的研究中還存在一些問題，但通過國內外的研究者們的不懈努力，相信這些問題很快就會被解決，開辟真菌毒素研究的新領域。

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作者：王玉嬌 張瑞英 蘭靜 張守文 單位：哈爾濱商業大學食品工程學院 黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所