低溫氨氮降解菌的篩選范文

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《生物技術雜志》2014年第二期

1方法

1.1菌株富集培養取100mL松花江水放入無菌的500mL三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養3～5d直至培養液渾濁，4℃保存備用。

1.2氨氮降解菌篩選取1mL富集培養液加入含100mL異氧硝化細菌培養基的三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養2d，倍比稀釋后，取103稀釋液100mL涂布在異氧硝化細菌固體平板上，8℃低溫培養2～4d，挑取單菌落劃線純化。采用納氏試劑平板法初篩脫氨氮菌株，取純化后的菌株點接在異氧硝化細菌固體平板上，8℃低溫培養2d，去掉菌落，加入5mL納氏試劑，測量菌落周圍的透明圈直徑。

1.3菌株鑒定形態鑒定:將培養24h的菌液，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察形狀大小。生理生化特性鑒定:按照參考文獻方法進行接觸酶、氧化酶、精氨酸雙水解酶、V.P試驗、M.R試驗、葡萄糖利用、明膠液化試驗。16SrDNA序列分析:用LB培養基培養菌株，離心收集菌體，用北京康為世紀細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，用細菌通用引物Primer1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT進行PCR擴增，將PCR產物測序，在NCBI的BLAST數據庫中進行DNA序列分析，用MEGAversion4.1軟件構建系統進化樹。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統鑒定:按照BIOFOSUN微生物鑒定分析系統說明進行操作。

1.4菌株低溫氨氮降解能力測定用500mL基本培養液培養氨氮降解菌，離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，懸浮于5mL無菌水中，作為種子液。取1mL種子液接種到50mL新的異氧硝化細菌培養液中，3個平行樣，培養液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養液在8℃、160r/min震蕩培養2d，每隔4h取樣測定菌濁度OD600值、氨氮、硝態氮和亞硝態氮濃度，計算氨氮降解率。

1.5菌株的反硝化能力取1mL種子液接種到50mL新的反硝化細菌培養液中，3個平行樣，培養液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養液在8℃、160r/min震蕩培養1d，每個4h取樣測定菌濁度OD600值、硝態氮和亞硝態氮濃度，計算硝態氮降解率。

1.6分析方法采用納氏試劑光度法測定氨氮濃度，酚二磺酸光度法測定硝酸亞濃度，N－奈基－乙二胺光度法測定亞硝態氮濃度。取菌液樣品5mL，6000r/min離心5min，取1mL上清液測定，按公式氮降解率=C0－C1/C0×100%計算氮降解率，C0為初始氮濃度，C1為殘留氮濃度。

2結果與分析

2.1氨氮降解菌篩選與鑒定松花江水經富集和分離，采用納氏試劑平板法篩選，獲得8株氨氮降解菌(圖1)，菌株WSW－1001半透明圈直徑最大為15mm。該菌株菌落白色、圓形、光滑，邊緣整齊，菌體短桿狀，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革蘭氏陰性，好氧，氧化酶陽性，接觸酶陽性，精氨酸雙水解酶陽性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P陰性，M.R陰性，液化明膠。PCR擴增產物大小1400bp，與NCBI數據庫中的Pseudomonas.fluorescensp1－1同源性為99%(圖3)。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統分析結果表明該菌株與熒光假單胞桿菌聚為1組(圖2)。結合菌株WSW－1001的形態學和生理生化特性，以及16SrDNA序列分析和BIOFOSUN微生物鑒定系統分析結果，菌株WSW－1001被鑒定為熒光假單胞桿菌Pseudomonasfluorescens。

2.2菌株低溫氨氮降解能力菌株WSW－1001低溫氨氮降解效果見圖4。菌株在8℃條件下具有較強的脫氮能力，48h內，隨著菌體的生長，氨氮濃度持續下降，24h對初始氨氮濃度為5.23mg/L的氨氮降解率為71.7%，48h的降解率為80.4%，脫氮過程中無亞硝態氮積累，有少量(約0.48mg/L)硝態氮產生。

2.3菌株的異氧反硝化能力菌株WSW－1001在以硝酸鉀為唯一氮源的培養基中生長與硝態氮含量變化情況見圖5。菌株在8℃條件下能夠利用硝態氮生長，24h對初始5.03mg/L硝態氮的降解率為3討論納氏試劑光度法是測定氨氮常用方法，納氏試劑與氨氮反應生成黃棕色絡合物，顏色深淺與氨氮濃度成正比。固體平板中的氨氮被微生物降解后不能與納氏試劑進行顯色反應，因此可以通過菌落周圍半透明圈大小定性測定固體平板上生長的菌株氨氮降解能力。本研究采用納氏試劑平板法可以對氨氮降解菌進行快速初篩。細菌的鑒定方法包括傳統方法、分子生物學鑒定和儀器自動化鑒定，每種方法都有其各自的優缺點，三種方法結合可以確保鑒定結果的準確性。國內外對于異氧硝化細菌的研究報道較多，多數菌株在常溫下脫氮效率較高，辛玉峰等報道不動桿菌YF14在30℃培養3d，可去除92%的氨氮，邱曉帆等報道1株假單肥菌WSH1001在20～35℃培養9h，氨氮去除率達95%。對于低溫菌的研究報道較少，本文報道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報道。ZhangD等人報道從松花江水中分離出1株異氧硝化細菌MicrobacteriumspSFA13，5℃培養30h后對5.09mg/L初始氨氮的降解率為63.6%;ZhangJ等人報道PseudomonasstutzeriYZN－00110℃培養2d氨氮降解率為45.5%。本文報道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報道。

異氧硝化細菌的脫氮途徑因菌株而異。菌株WSW－1001在氨氮降解過程中檢測到少量硝態氮和微量亞硝態氮，說明該菌株能夠通過硝化作用去除氨氮。該菌株能夠利用硝酸鹽生長，而且能夠檢測到微量亞硝酸鹽生成，說明菌株具有反硝化功能，由于沒有對菌株代謝過程中與硝化和反硝化作用相關的生化酶進行檢測，也沒有對氨氮降解后的最終產物進行檢測，因此不能明確該菌株的脫氮途徑。菌株WSW－1001的脫氮效率與菌株的生長速度有關，生長速度越快，氨氮降解率越高。菌株生長初期，氨氮降解效率較低，降解的氨氮主要用于菌株生長，隨著菌株生長，產生一系列生化反應，對氨氮進行生物降解。

作者：張淑梅姜威李晶孟利強曹旭陳靜宇趙曉宇張云湖單位：黑龍江省科學院微生物研究所黑龍江省科學院高技術研究院