琥珀酸木糖發(fā)酵的研究范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了琥珀酸木糖發(fā)酵的研究參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《生物技術(shù)雜志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料野生型大腸桿菌(E.coli)MG1655、K－12、W3110、C－1、2507、5365、W1485由作者實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌MLB(MG1655△ldhA、△pflB)與CLB(C－1△ldhA、△pflB)由本研究構(gòu)建。質(zhì)粒pKD4、pKD46、pCP20為作者實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑膠回收試劑盒、DN段純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、Taq酶由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供;DNAmarker、dNTP、λ－EcoT14Marker、DL2000DNAMark-er、PCRbuffer、DpNⅠ由Takara公司提供。NH4Cl(Ammoniumchloride)、KH2PO4(Potassiumdihydro-genphosphate)、CaCl2(Calciumchlorideanhydrous)、NaOH、H2SO4、Tris－HCl、NaCl(Sodiumchloride)，分析純AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;MgSO4•H2O(Magnesiumsulfate)，分析純AR，上海美興化工有限公司;瓊脂粉(Agar－agarpower)，生化試劑BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Tryptone、YeastEx-tract，OxoidLTD;氨芐青霉素(AmpicilinSodiumSalt)、卡那霉素(KanamycinSulfate)，分析純AR，Genebase。

1.1.3儀器設(shè)備分析天平，上海奧豪斯公司;不銹鋼手提式滅菌鍋DSX－280B，上海申安醫(yī)療器械廠;DHG－9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Eppendorf高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司;精密數(shù)顯酸度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司;SW－CJ－1FD單人單面潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;BIOERPCR儀，杭州博日科技有限公司;DY－A電泳儀，上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司;瓊脂糖水平電泳槽YR－158，上海伊瑞生物科技儀器有限公司;高速離心機(jī)，ThermoSCIENTIFIC;高壓蒸汽滅菌器，TOMYSX－700;恒溫?fù)u床，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;酸度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司;ZC－10智能型恒溫水槽，寧波天恒儀器廠;液相色譜儀，日本島津公司。1.1.4培養(yǎng)基①LB培養(yǎng)基(/L):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。②固體LB培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉。③種子培養(yǎng)基(/L):木糖5g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，氯化銨1g，1%維生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。④搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):木糖15g，NaHCO315g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，1%維生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。⑤抗生素母液的配制:用分析天平分別稱取0.5000g卡那霉素、0.5000g氨芐青霉素，分別溶于10ml超純水，潔凈工作臺(tái)下用微孔過濾膜(0.22μm)過濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)，培養(yǎng)基中氨芐青霉素的終濃度為100μg/ml，卡那霉素的終濃度為50μg/ml。

1.2方法

1.2.1野生型大腸桿菌搖瓶發(fā)酵①搖瓶發(fā)酵:采用兩階段法發(fā)酵，即先好養(yǎng)階段培養(yǎng)，主要用于收集菌體，然后轉(zhuǎn)入?yún)捬酰_始發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)方法:將1mL冷凍甘油管保存的菌液接入到已滅菌的裝有30mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、220r/min培養(yǎng)9h;取LB中活化的種子培養(yǎng)液2mL轉(zhuǎn)接于裝有100mL二級(jí)種子培養(yǎng)基中的500mL搖瓶中，于37℃、220r/min培養(yǎng)約10h，此時(shí)好養(yǎng)階段結(jié)束;然后8000r/min、4℃離心5min，收集菌體并重懸于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分裝在兩個(gè)50ml藍(lán)口瓶中，裝液量為40ml，藍(lán)口瓶上方用CO2氣袋通過滅菌的空氣過濾器通氣約30s，180r/min、37℃下厭氧發(fā)酵10h。②發(fā)酵產(chǎn)物的檢測:取1ml發(fā)酵液，離心后，過濾上清液用于HPLC測定。進(jìn)樣量60μl，色譜柱Bio－RadAminexHPX－87H，柱溫為65℃，流動(dòng)相為5mmol/L的稀硫酸，流速設(shè)定為0.6ml/min。

1.2.2利用Red重組法構(gòu)建大腸桿菌MLB與CLB實(shí)驗(yàn)步驟:引物設(shè)計(jì)→PCR、電泳、回收→酶切→電泳、再回收→制備感受態(tài)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKD46→回收片段與感受態(tài)混合電轉(zhuǎn)→涂卡那霉素平板→挑取菌落鑒定→pKD46質(zhì)粒丟失→制備感受態(tài)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCP20→抗性片段的消除、鑒定。實(shí)驗(yàn)中所有引物由軟件PrimerPremier5設(shè)計(jì)，由上海生工有限公司合成。基因敲除所用的引物見表1，5’端50bp堿基序列為靶基因兩側(cè)的同源臂，表中斜體部分，電擊時(shí)，PCR擴(kuò)增出的線性片段與靶基因的同源區(qū)域能夠發(fā)生同源重組置換，達(dá)到敲除目的，用鑒定引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)一步測序確認(rèn)。然后導(dǎo)入質(zhì)粒pcP20消除抗生素片段的抗性，從而敲除ldhA基因，構(gòu)建菌株ML。以ML為出發(fā)菌株，重復(fù)上述方法敲除pflB，從而構(gòu)建MLB。CLB菌株的構(gòu)建方法類似。

1.2.3兩階段搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方法同1.2.1發(fā)酵產(chǎn)物的檢測:檢測方法見1.2.1。

2結(jié)果與分析

2.1野生菌搖瓶發(fā)酵本研究首先對(duì)不同野生型大腸桿菌的木糖利用和產(chǎn)酸情況進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。在以木糖為碳源兩階段搖瓶發(fā)酵中，不同的菌株表現(xiàn)出了顯著的差異，這幾組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示其p值為0.0045＜0.01，表明其統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異極其明顯。從表2中可以看出在這些野生型菌株中，琥珀酸產(chǎn)量和得率最高的是大腸桿菌B系的5365菌株，其產(chǎn)量為6.41g/L，得率為0.53g/g，其次是C－1菌株，產(chǎn)量為5.58g/L，得率為0.47g/g，而產(chǎn)量最低的是W3110，其產(chǎn)量只有4.23g/L，而得率僅有0.34g/g。同時(shí)，可以看出野生菌株的副產(chǎn)物占了較大比例，其中乳酸的積累是最多的。乳酸的形成對(duì)琥珀酸影響最大，一方面是碳源的分流，更重要的是乳酸途徑會(huì)競爭NADH，而降低琥珀酸的產(chǎn)量。乙酸的積累雖然較乳酸相對(duì)少些，但仍然對(duì)碳源分流造成了較大影響。

2.2副產(chǎn)物途徑敲除根據(jù)野生菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇W1485、MG1655、C－1三株菌進(jìn)行副產(chǎn)物途徑敲除的探索，其琥珀酸的產(chǎn)量高低順序都為C－1﹥MG1655﹥W1485，C－1菌株的副產(chǎn)物相對(duì)較少，琥珀酸得率較W1485高出了17.5%。副產(chǎn)物途徑敲出的構(gòu)建，主要是進(jìn)行乳酸脫氫酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的敲除。其中NZN111是W1485的雙缺失菌株，而MLB和CLB分別在本研究中由MG1655和C－1構(gòu)建的雙缺失菌株。圖1和2是雙缺失菌株構(gòu)建完成后，進(jìn)行PCR證的結(jié)果。鑒定引物分別以陽性克隆、野生型為模板，陽性克隆中l(wèi)dhA基因已被卡那霉素片段替換，ldhA基因大小為990bp，pflB基因大小為2183bp，卡那霉素片段大小為1438bp，從圖1可以看出對(duì)照組擴(kuò)增出片段大小與ldhA大小接近，陽性克隆大小與卡那霉素片段接近，從圖2可以看出對(duì)照組擴(kuò)增出片段大小與pflB大小接近，陽性克隆大小與卡那霉素片段接近，初步鑒定基因敲除成功，進(jìn)一步測序結(jié)果顯示，基因敲除成功。

2.3NZN111、MLB、CLB的搖瓶發(fā)酵大腸桿菌雙基因缺失菌株NZN111、MLB、CLB菌株的搖瓶發(fā)酵木糖結(jié)果如表3。從表3可以看出，菌株的ldhA和pflB雙缺失后，對(duì)于提高菌株的產(chǎn)酸得率非常有效，MLB與NZN111基于木糖產(chǎn)琥珀酸的得率基本一致，分別為0.89g/g與0.90g/g，而CLB略高為0.92g/g，三個(gè)菌株的產(chǎn)物和副產(chǎn)物的產(chǎn)量比較接近。與野生型菌株比較，木糖的消耗沒有減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示這三組數(shù)據(jù)p值為0.145＞0.05，表明這三株雙缺失菌株產(chǎn)琥珀酸顯著性差異不明顯，與野生型菌株相比，雙缺失后菌株之間的產(chǎn)琥珀酸能力的差異縮小。但與野生型菌株相比琥珀酸的產(chǎn)量和得率都有顯著提高，將表3中MLB、CLB菌株與表2中MG1655、C－1菌株琥珀酸產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得其p值分別為0.00069＜0.001、0.00044＜0.001，這表明雙缺失菌株與其對(duì)應(yīng)的野生菌產(chǎn)琥珀酸的量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異極其顯著。MG1655菌株琥珀酸對(duì)木糖得率為0.40±0.01g/g，敲除基因ldhA與pflB后，得率提高到0.89±0.02g/g;而C－1菌株琥珀酸對(duì)木糖得率為0.47±0.01g/g，敲除基因ldhA與pflB后，得率提高到0.90±0.02g/g。CLB菌株的乙酸生成變化不大，而MLB和NZN111的乙酸生成明顯減少，而乳酸基本檢測不到，因此乳酸脫氫酶的敲除對(duì)副產(chǎn)物乳酸的合成能夠有效的控制，并且考慮到乳酸合成途徑中NADH的需求，該途徑的活性確實(shí)造成了琥珀酸NADH途徑流量的競爭。丙酮酸甲酸裂解酶能夠催化丙酮酸裂解為甲酸，甲酸在甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase)催化下進(jìn)一步生成H2和CO2，該支路也為琥珀酸合成的競爭途徑，pflB基因的缺失可以減少副產(chǎn)物的比例，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和得率。特別是乳酸途徑、乙醇途徑和琥珀酸途徑競爭NADH，因此pflB與ldhA的敲除能顯著減少木糖代謝途徑中的副產(chǎn)物的產(chǎn)量，有利于琥珀酸的高產(chǎn)。

3討論

本研究通過比較野生型大腸桿菌利用木糖兩階段發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)琥珀酸得率最高的是大腸桿菌B系的5365菌株，其產(chǎn)量為6.41g/L，得率為0.53g/g，其次是C－1菌株，產(chǎn)量為5.58g/L，得率為0.47g/g，而產(chǎn)量最低的是W3110，其產(chǎn)量只有4.23g/L，得率僅有0.34g/g，為選取優(yōu)良野生菌發(fā)酵木糖產(chǎn)琥珀酸提供了一定的依據(jù)。并利用Red重組法敲除野生菌的ldhA與pflB，構(gòu)建了兩株雙基因缺失型菌株，發(fā)酵結(jié)果表明琥珀酸對(duì)木糖的得率顯著提高，達(dá)到0.90g/g，與王健等人研究結(jié)論相比，得率提高了50%。目前，以木糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的研究不多，特別是厭氧發(fā)酵的研究較少，當(dāng)前熱點(diǎn)主要集中在利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸。然而，木糖是木質(zhì)纖維素水解液的重要組分，是除葡萄糖以外第二豐富的單糖，利用木糖產(chǎn)琥珀酸同樣具有廣闊的前景。本研究結(jié)果表明利用木糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸雖然得率較高(達(dá)到0.92g/g)，然而產(chǎn)量仍然較低，如何在發(fā)酵罐中通過發(fā)酵優(yōu)化來提高琥珀酸的產(chǎn)量也是下一步研究中亟待解決的問題。

作者：唐緒位李運(yùn)杰李志敏葉勤單位：華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室