色譜分析法在生物科學研究中的實踐范文

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1氨基酸分析

1．1液質聯用技術液質聯用技術將高效液相色譜儀與質譜儀聯接起來使用，即把色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜的強定性能力結合起來，在氨基酸分析中得到了廣泛的應用。與一般的液相色譜法相比，液—質聯用技術不但可分離各種氨基酸，而且可以對未知的氨基酸成分進行鑒定;由于使用質譜儀作為檢測部件，還可以不用對樣品進行衍生。王萍等采用高效液相色譜—電噴霧質譜法鑒定出了青稞幼苗提取物中的13種氨基酸，證明是一種理想的全譜氨基酸分析方法。Maoetal也利用液質聯用技術測定了生物樣品中6種硒代氨基酸。此外，串聯質譜技術在氨基酸分析中的應用也受到了關注。湯新星等基于高效液相色譜—電噴霧串聯質譜及固相萃取技術，建立了分析大鼠血漿中氨基酸的方法，為篩選新的急性輻射損傷標記物提供了實驗依據。

1．2氣質聯用技術氨基酸也可通過氣相色譜法進行分離，但氨基酸沸點高，必須通過衍生化處理成為低沸點、易氣化的化合物，再利用試樣中各組分在兩相間的分配系數不同進行分析。目前最常用氣質聯用技術對氨基酸進行檢測。王建等利用鹽酸把菌體蛋白水解成氨基酸，再通過分離、濃縮、真空干燥、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺衍生化后得到的衍生物進行氣相色譜分離和質譜法檢測，獲得了15種菌體蛋白氨基酸的13C標記豐度信息。李長田等采用氣相色譜—質譜法測定了松茸子實體和液體發酵菌絲體氨基酸等物質，結果表明，松茸子實體和發酵菌絲體二者氨基酸的種類相同，但發酵菌絲體中某些氨基酸的含量高于子實體中的含量。Mudiametal則首次應用固相微萃取—氣質聯用技術測定了尿液和毛發中的20種氨基酸，在分離前采用氯代甲酸乙酯對氨基酸進行柱前衍生化處理，該方法靈敏、快速。

1．3超高效液相色譜技術超高效液相色譜技術是色譜分析技術的最新發展成果之一，與常規高效液相色譜相比，最主要的差別是采用了超微細度的固定相顆粒，因而單位柱長的柱效大大提高，實際使用中就可用更短的色譜柱達到常規色譜柱的分離效果，使得整個分析時間大大縮短。該技術已應用于許多樣品中氨基酸成分的分析［1，15，19］。孫言春等利用超高效液相色譜法測定了史氏鱘、達氏鰉和小體鱘卵中17種氨基酸的含量，完成一次分析僅需10min。超高效液相色譜法還被應用于快速分析和鑒定3種生菜中的氨基酸，并發現了10種由已知氨基酸和倍半萜內酯所形成的新結構單元，為生菜等植物所具有的潛在生物活性找到科學依據。

2蛋白質分析

蛋白質是生命的物質基礎，幾乎參與生命活動的每一環節，在機體的生長、發育、代謝、衰老等過程中發揮重要作用。但蛋白質種類很多，在分子量大小、帶電性、分子結構和生物特異性等方面均有很大差異。因此在分離模式、定量和定性方法上都有很大差別。根據分離原理的不同，用于蛋白質測定的液相色譜法主要可分為反相色譜法、排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、疏水相互作用色譜法和逆流色譜法等。此外，還包括基于色譜分離技術和檢測技術等發展而來的液質聯用技術、多維液相色譜法和超高效液相色譜法等。目前用于生物樣品中蛋白質檢測的主要方法及其典型應用見表2。

2．1反相色譜法反相色譜法主要利用被測組分對極性流動相和非極性固定相的作用力不同加以分離。這種分離系統在液相色譜分離模式中使用最為廣泛。對于生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關注。Silvaetal采用反相色譜—質譜技術分離測定了人血清中的11種常規蛋白的濃度;王娟等采用AgilentZorbax300SB-C8色譜柱，建立了測定牛奶中主要蛋白質(4種酪蛋白與乳清蛋白)的反相高效液相色譜法，在波長214nm處對分離后的蛋白質進行紫外檢測。于海洋等則用納升級反相液相色譜—串聯質譜系統分析了錦燈籠果實提取物中蛋白質的酶解產物，鑒定得到60種蛋白質，其中與抗氧化相關的蛋白質有3種。

2．2排阻色譜法排阻色譜法是根據被測組分在固定相中的滲透能力不同而分離的。這種色譜法采用多孔性凝膠為固定相，較小的分子較易被保留，因而是依照分子量的大小順序出峰。生物體中各種蛋白質分子量常常差異很大，很適合用排阻色譜法進行分離。利用排阻色譜法將溶液中的蛋白質按照分子量大小進行分離，再配合特征波長的紫外檢測器，可有效地將目的蛋白捕獲并測定。Bondetal借助排阻色譜技術，并配合雙波長紫外檢測，研究了在不同環境條件下IgG1單克隆抗體的含量水平及聚合降解等特性。重組人白介素-1受體拮抗劑蛋白的測定也可采用這種方法，在0．018－2．4mg•mL－1范圍內，該方法的線性關系良好，回收率為99．1%，相對標準偏差為1．09%。

2．3離子交換色譜法離子交換色譜法主要是利用蛋白質在pH值高于或低于等電點時可分別帶負電荷和正電荷的特點而進行分離。不同蛋白質組分離子對作為固定相的離子交換劑的交換能力不同，保留時間也不同。在大孔硅膠表面通過聚合鍵入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨制得的強陰離子交換色譜填料，可用于雞蛋中卵清蛋白的分離純化，所需時間在20min之內。隋少卉等則用強陽離子交換色譜分離了肝癌細胞中磷酸化蛋白，并與等電聚焦技術進行比較，結果表明，在分離效果方面前者優于后者，但在定量分析的穩定性方面，后者則優于前者。在多維色譜分離系統中，離子交換色譜常被作為第一維，以實現對蛋白質混合物的預分離。

2．4液質聯用技術蛋白質在紫外區有吸收，因此在分離之后可以不經衍生直接用紫外檢測器測定，但紫外檢測器對蛋白質的鑒定能力差。液質聯用法兼具強分離和強定性能力，而且靈敏度高，更適合于復雜蛋白質的分析。各種類型的色譜分析法都可與質譜法聯用，實現對蛋白質的高效分析。這種色質聯用技術已用于毛白楊次生維管系統蛋白、人體腸組織運輸蛋白和晶狀體蛋白等的分析測定。

2．5多維高效液相色譜法多維高效液相色譜法是利用兩根或多根性質不同的色譜柱，通過一定的接口和切換技術進行不同色譜分離模式的組合，完成對復雜樣品中待分析組分的分離。與一維液相色譜相比，多維液相分離系統具有更高的峰容量和分離能力，因而已在蛋白質分析和蛋白質組學研究中得到越來越多的應用。其中，離子交換色譜—反相高效液相色譜是最常用的分離系統。血漿中高豐度蛋白質的存在嚴重干擾低豐度蛋白質的檢測，利用強陰離子交換色譜—反相高效液相色譜二維液相色譜技術，可使血漿蛋白質得到充分分離，再借助串聯質譜對血漿中的高豐度蛋白質進行色譜定位并去除。

2．6超高效液相色譜技術超高效液相色譜技術已用于大鼠肝組織、人體膜組織蛋白及奶粉等生物樣品中蛋白質的快速檢測。Jietal建立了超高效液相色譜—多反應監測串聯質譜法，可同時測定3種人細胞膜運輸蛋白，線性范圍為0．2－20μg•mL－1，精密度和準確度均可控制在15%以下，為膜蛋白在人體內外表達的研究提供幫助。Zhangetal把超高效液相色譜—串聯質譜法應用于嬰幼兒配方奶粉和乳清蛋白濃縮物中牛乳清蛋白含量的測定，該方法的回收率、重現性和檢出限均符合實際樣品測定的要求。

3小結

綜上所述，色譜分析技術可應用于不同生物樣品中各種氨基酸和蛋白質的含量分析和組成鑒定。色譜分析技術已從較簡單的氣相色譜和液相色譜技術，發展到色譜—質譜聯用技術，再到多維色譜技術和超高效液相色譜技術等等。隨著科技的進步和生物科學研究的不斷深入，將會有更多符合實際需要的新色譜技術出現，可為氨基酸和蛋白質的分析尋找到更加理想的分離檢測模式。

作者：張舒歡周碧青單位：福建農林大學生命科學學院福建農林大學測試中心