番茄紅素在大鼠肝臟中的幾何異構體范文

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《食品科學雜志》2015年第二十四期

摘要：

本項研究的目的是測定大鼠肝臟組織中番茄紅素的含量及番茄紅素幾何異構體（順/反異構體）的組成，為番茄紅素在體內的代謝及生物學功能研究奠定基礎。在實驗中，選用大鼠為動物模型，用番茄提取物配制灌胃液。一次灌胃8小時后取大鼠肝臟組織，提取其中的番茄紅素。應用C30-HPLC-PDA法測定提取物中番茄紅素的總量和幾何異構體組成。實驗結果表明：肝臟中總番茄紅素含量為92.95微克/克鮮重。與灌胃液中的番茄紅素幾何異構體組成比較，肝臟組織中存在更多數量和種類的順式異構體，包括：13順-、11順-、9順-和5順-異構體。這一現象對研究番茄紅素在肝臟內的貯存、靶向調動和生物學功能研究具有重要意義。

關鍵詞：

番茄紅素；幾何異構體；肝臟；C30-HPLC；代謝

番茄紅素（Lycopene）是一種類胡蘿卜素（Carotenoid），由碳氫元素組成。其半系統命名為　　　　胡蘿卜素，分子式為C40H56。番茄紅素分子由中央多聚烯鏈和開環末端基團構成。由于其具有高度的不飽和性，番茄紅素因此在理論上可形成多種幾何異構體。在自然界中番茄紅素通常以全反式異構體（AllE-isomer）的形式存在。其分子結構見圖1。在自然界中，番茄紅素同時還存在著少量順式異構體（Z-isomer）。最常見的有13-、9-和5-三種單順式異構體[1]。由于其分子空間結構不同，番茄紅素各異構體的生物學功能也有所不同。根據文獻報道，在體外抗氧化實驗中，全反式異構體的抗氧化性明顯優于順式異構體。但由于順式異構體在體內溶解性好，生物利用度高，故其在體內的抗氧化性反而高于全反式異構體[2]。

番茄紅素具有預防與治療多種疾病的功能。這方面的研究成果及報道迅速增多，如：防治前列腺增生及癌癥[3]、體內抗氧化[4]、抗消化道癌變[5]、降低肺癌風險[6]、抗糖尿病[7]、控制體重[8]等。因此番茄紅素也被越來越多地考慮應用在功能性食品中[9]。這些應用推動了對番茄紅素在體內吸收、轉運和代謝的研究，但目前其相關報道十分有限。已有的報道可概括為：被人體攝入的番茄紅素經小腸吸收進入血清，然后被轉運到靶器官。其中一部分轉運到肝臟中貯存。當靶器官需要時，再從肝臟調出，再經血清轉運至靶器官參與代謝反應（如圖2所示）[10]。肝臟在這一過程中被認為執行了“庫”的功能。因此，研究肝臟中番茄紅素的存在形式對探討其在體內的轉運和在靶器官中發生的代謝反應機制具有重要意義。惠伯棣等人已經報道了一次口服番茄紅素后雄性大鼠肝臟中番茄紅素的積累情況[11]和應用C30-HPLC-PDA分離和檢測番茄紅素幾何異構體的方法[12,13,14,15]。在本項研究中，采用了這一方法對肝臟中的番茄紅素幾何異構體組成進行了檢測。希望這一檢測的結果對揭示番茄紅素在體內的轉運和代謝機理有一定幫助。

1.材料與方法

1.1番茄萃取物果實在本項研究中使用的番茄萃取物由新疆紅帆生物科技有限公司提供，該產品為番茄果皮的超臨界CO2流體萃取物。其總類胡蘿卜素含量為6%（W/W）。其中，番茄紅素占94.74%（W/W），　-胡蘿卜素占5.26%（W/W）。

1.2試劑番茄紅素參比樣品（P/N：L9879）購自Sigma公司，番茄紅素含量在90-95%范圍內。使用前用本項研究中采用的色譜條件檢測了其番茄紅素幾何異構體組成。其全反式異構體的比例大于99%。故使用前未經進一步純化。萃取用正己烷、甲醇、石油醚（BP：60-90℃）為分析純試劑，購自北京化工廠。色譜用流動相乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）為色譜純試劑，購自迪馬公司（DickmaTechnologies,USA）。

1.3實驗動物SD雄性大鼠購自北京大學醫學部實驗動物中心，體重350克（±5克）。實驗動物合格證號：SCXK京2006-0008。

1.4儀器Multispec-1501型紫外-可見光分光光度計（SHIMADZU，Japan）；HPLC：Waters1525系統配有PDA-2996檢測器（Waters，USA）。

1.5灌喂劑量的選擇本項研究中選用的番茄紅素灌胃劑量參照李京等在番茄紅素血清動力學研究中的劑量[16]，為5.25mg/次•只，折合標準體重（50公斤）人體攝入量為150mg/次•人。

1.6灌胃液的配制稱取一定量的番茄萃取物完全溶于正己烷中，再混溶于100mL豆油中。在旋轉蒸發儀上，在45℃、-0.06MPa、避光條件下將正己烷完全蒸出。用石油醚定量稀釋油溶液。在紫外-可見光分光光度計上，在475nm下，比色稀釋液。根據下式計算油溶液中番茄紅素的濃度[17]。最終，使配制成的番茄紅素油溶液濃度為5.25mg/ml。避光保存。操作注意事項：（1）在蒸發正己烷期間應注意嚴格避光，以避免在加熱的狀態下油溶液中大量全反式番茄紅素發生幾何異構化。（2）灌胃液的配制應遵循隨用隨配的原則。不建議將其放在冰箱中貯存。原因是在4℃條件下番茄紅素在油溶液中已形成顆粒結晶，導致灌胃液不均勻和生物利用度的下降。

1.7實驗動物灌胃與肝臟收集雄性SD大鼠在動物房中用標準飼料飼養3天。隨機分成2組。第一組6只，第二組3只。第一組每只灌胃1mL灌胃液。根據李京等人的報道[20]：攝入番茄紅素12小時后，血清中番茄紅素水平下降到最低檢測限。根據惠伯棣等人的報道[11]，攝入番茄紅素8小時后，雄性大鼠肝臟中番茄紅素積累水平達到最高值。因此，在本實驗中，灌胃8小時后采用股動脈放血法處死大鼠，取肝臟。平均肝重為11.72±0.74克。第二組每只灌胃1mL豆油。灌胃8小時后采用股動脈放血法處死大鼠，取肝臟。平均肝重為11.81±0.24克。

1.8番茄紅素的萃取與濃縮本研究中所采用的肝臟中總類胡蘿卜素萃取方法參照F.Khachik于1992年報道的方法[21]，并作了相應的優化，以使番茄紅素的萃取率提高，降解率最低。在實驗中，將大鼠肝臟用組織勻漿器進行破碎后，取4克肝臟勻漿液加入2mL（-20℃）甲醇，振蕩30秒，沉淀蛋白。向帶有蛋白沉淀的懸濁液中加入3mL正己烷，振蕩10min。在4600rpm下離心10min，取上清液2.6mL，用N2吹干至1mL。全程避光，并于冰浴中操作。按上述方法萃取每只大鼠肝臟中的類胡蘿卜素，肝臟提取物樣品用于HPLC分析前10000rpm離心3min。取上清液進樣。

1.9肝臟萃取物的C30-HPLC-PDA分析用于本項研究的C30-HPLC-PDA設備具有良好的穩定性和重現性（RSD<7%）。HPLC條件已由丁靖等人報道[17]，并優化如下：HPLC條件：色譜柱：YMCCarotenoidS-5（4.6×250mm）；流動相A：乙腈-甲醇（3:1,V/V）；流動相B：MTBE；流動相A與B中分別加入0.05%（V/V）三乙胺；線性梯度洗脫：B在8min內由0增加至55%（V/V）；8-40min內B維持在55%；流速：1.0mL/min；檢測波長：475nm；PDA光譜收集范圍260-600nm；進樣量：20　L。對各組分積分得峰面積。

1.10灌胃液的C30-HPLC-PDA分析取0.5mL灌胃液，用正己烷定容至50mL。取1mL定容液，在10000rpm下離心3min。取上清液進樣。色譜條件見1.9節。

1.11標準曲線的測定準確（至0.0001克）稱取番茄紅素參比樣品1mg，加入1mL二氯甲烷使其完全溶解，轉移至25mL棕色容量瓶中，用石油醚（BP:60～90°C）定容至25mL，配制成40　g/mL的儲備液，保存于-20℃冰箱中。使用前用石油醚配制6個不同質量濃度的工作液。分別進樣，在C30-HPLC上測定全反式番茄紅素組分含量與其色譜峰面積的相關關系，得到濃度-峰面積線性回歸曲線和方程，R2為0.996。

1.12各番茄紅素幾何異構體組分的定性與定量根據組分的色譜行為和光譜特征對番茄紅素幾何異構體進行鑒定。對各組分在色譜圖上峰面積和濃度-峰面積線性回歸方程，計算各組分的質量濃度。根據李京等人的報道[22]，雖然番茄紅素順式異構體的吸光系數與全反式異構體的不同，但這一結果尚未經其他實驗室證實。因此，在本項研究中時，依舊根據全反式異構體的吸光系數計算順式異構體的含量。

2.結果與分析

2.1灌胃液中類胡蘿卜素組分的分離由新疆紅帆生物科技有限公司提供的番茄紅素萃取物為番茄果皮的超臨界CO2萃取物，該萃取物中所含主要類胡蘿卜素為番茄紅素，此外，還含有少量的　-胡蘿卜素。其中除全反式番茄紅素外，還含有少量的順式番茄紅素。圖3為這一萃取物的C30-HPLC-PDA色譜圖。組分I的保留時間與番茄紅素全反式異構體參比樣品的保留時間一致。

2.2肝臟萃取物中類胡蘿卜素組分的分離根據惠伯棣等人的報道[11]，灌胃8小時后，雄性大鼠肝臟中番茄紅素的積累量達到最高水平。因此，在本項研究中，在灌胃8小時后，摘除大鼠肝臟，取4克肝組織，萃取其中的類胡蘿卜素，用C30-HPLC-PDA，分離其中的類胡蘿卜素組分。圖4為灌胃8小時后肝臟萃取物的C30-HPLC色譜圖。組分I的保留時間與番茄紅素全反式異構體參比樣品的保留時間一致。

2.3各組分電子吸收光譜特征比較使用HPLC上配備的PDA檢測器，可在線采集各組分的電子吸收光譜。圖5為組分I、II、III、IV和V的電子吸收光譜比較。表1為各組分電子吸收光譜特征比較。從表中可以看出，五個組分的主吸收帶最大吸收波長發生了7nm的變化。順式峰最大吸收波長（362nm）未見明顯變化。

2.4灌胃液與肝臟提取物中番茄紅素幾何異構體的定性根據各組分的色譜行為和光譜特征對各組分定性。定性結果認為I、II、III、IV、V和VI分別為全反式-番茄紅素、5順-番茄紅素、9順-番茄紅素、11順-番茄紅素、13順-番茄紅素和　-胡蘿卜素，其中除了組分IV未得到質譜數據支持，其它均有參考文獻支持。圖6為各順式異構體的分子結構。

2.5灌胃液與肝萃取物中番茄紅素幾何異構體的定量表2為各異構體組分的含量。從表2可以看出：在灌胃液中，番茄紅素以全反式異構體為主存在形式，此外還含有少量的11-順式異構體，其它種類異構體比例極低。與灌胃液中的情況相比，肝臟中含有大量的番茄紅素順式異構體，包括：13-順式異構體、11-順式異構體、9-順式異構體和5-順式異構體。換言之，從肝臟檢出的番茄紅素組分中，順式異構體比例明顯上升，總順式異構體比例超過60%。同時，全反式番茄紅素比例下降。

3.討論

全反式番茄紅素在肝臟中以大量順式異構體形態存在的現象在國內外文獻中未見報道。這一現象的發現可能對番茄紅素生物學功能和在體內代謝的研究產生重要的影響。根據李京等人的報道[20]，番茄紅素在血中的存在形式就包括大量的順式異構體。因此，來自消化道的全反式異構體發生順式異構化的位置應該不在肝臟中。此外，由于不同異構體在體內的溶解性和抗氧化能力均有所不同[23]，可以設想在肝臟內中存在的順式異構體具有不同于全反式異構體的生物學功能。當體內靶器官需要調動貯存在肝臟內的番茄紅素時，肝臟中的各種幾何異構體以何種形態和數量再度進入血液是非常有價值進行探討的問題。上述問題的探討將有助于推動番茄紅素在體內的代謝和生物功能研究的進一步發展。

參考文獻：

[1]惠伯棣.類胡蘿卜素化學及生物化學[M].北京:中國輕工業出版社,2005:262-265.

[2]李京,惠伯棣,裴凌鵬.番茄紅素—被關注的功能因子[J].食品科學,2005,26(8):461-464.

[3]ANTWISO,STECKSE,ZhangH,etal.Plasmacarotenoidsandtocopherolsinrelationtoprostate-specificantigen(PSA)levelsamongmenwithbiochemicalrecurrenceofprostatecancer[J].CancerEpidemiology.2015,S1877-7821(15):136-138.

[4]COCATEPG,NATALIAJ,ALFENASRC,etal.CarotenoidconsumptionisrelatedtolowerlipidoxidationandDNAdamageinmiddle-agedmen[J].BritishJournalofNutrition.2015,6:1-8.

[5]KIMMJ,KIMH.AnticancerEffectofLycopeneinGastricCarcinogenesis[J].JournalofCancerPrevention.2015,20(2):92-96.

[6]AsbaghiS,SaedisomeoliaA,HosseiniM,etal.DietaryIntakeandSerumLevelofCarotenoidsinLungCancerPatients:ACase-ControlStudy[J].Nutrition&Cancer.2015,7:1-6.

[7]YEGINSÇ,YURF,ÇETINS,etal.EffectofLycopeneonSerumNitrite-NitrateLevelsinDiabeticRats[J].IndianJournalofPharmaceuticalSciences.2015,77(3):357-60.

[8]POURAHMADIZ,MAHBOOBS,SAEDISOMEOLIAA,etal.TheEffectofTomatoJuiceConsumptiononAntioxidantStatusinOverweightandObeseFemales[J].Women&Health.2015,6:1-10.

[9]惠伯棣,石文娟,吳假峰等.番茄紅素的健康功能[J].中國食品添加劑,2009,(S1):267-271.

[10]何強強,惠伯棣,宮平等.類胡蘿卜素代謝物的生物學活性研究進展[J].食品科學,2011,32(15):289-295.

[11]惠伯棣,裴凌鵬,石文娟等.性別差異對天然番茄紅素在大鼠血清和肝臟中積累的影響[J].食品科學,2010,31(17):345-350.

[12]惠伯棣,張西,文鏡.反相C30柱在HPLC分析類胡蘿卜素中的應用[J].食品科學,2005,26(1):264-270.

[13]惠伯棣,李京,裴凌鵬.應用C30-HPLC-PDA分離與鑒定番茄紅素幾何異構體[J].食品工業科技,2006,27(7):49-51+54.

[14]李京,惠伯棣.秋橄欖果實中番茄紅素含量與幾何異構體組成分析[J].食品工業科技,2006,27(10):64-65.

[15]惠伯棣,劉沐霖,龐克諾等.食品中類胡蘿卜素幾何異構體組成的C30-HPLC檢測[J].中國食品添加劑,2007,(2):201-210.

[16]惠伯棣,李京,劉妍等.番茄果皮萃取物對大鼠血脂的調節作用初探[J].食品科學,2008,29(9):585-587.

[17]丁靖,惠伯棣,劉源.番茄果實中全反式番茄紅素的C30-HPLC外標法定量檢測[J].食品科學,2010,31(22):453-456.

[18]劉蕊,何強強,惠伯棣等.溶劑性質對番茄紅素電子吸收光譜特征的影響[J].食品科學,2013,34(19):46-51.

[19]何強強,惠伯棣,宮平.超臨界CO2密度對全反式番茄紅素吸光系數的影響[J].食品科學,2012,33(15):52-56.

[20]惠伯棣,李京,賈寧等.番茄果皮超臨界流體萃取物中類胡蘿卜素在大鼠血清中的積累[J].食品科學,2008,29(7):408-411.

[21]KHACHIKF,BEECHERG,GOLIMB,etal.Sepcrationandquanticationofcarotenoidsinhumanplasma[J].MethodsinEnzymology[J],1992,213:205-219.

[22]李京,惠伯棣,魏建華.應用C30-HPLC-PDA-ELSD估算番茄紅素順式異構體吸光系數[J].中國食品學報,2007,7(1):125-130.

[23]李京,惠伯棣.幾何異構化對番茄紅素淬滅單線態氧功能的影響[J].食品科學,2007,28(8):104-107.

作者：惠伯棣 馮潤月 宮平 單位：北京聯合大學應用文理學院食品科學系