淺析野生多孔菌的鑒定及生物學特性范文

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摘要:本研究通過對一株野生多孔菌子實體進行分離純化，并對獲得的菌株進行ITS鑒定。序列分析結果表明，該菌株與硬毛栓菌相似性為100%。進一步研究了不同溫度、碳源、氮源以及pH對野生多孔菌菌絲生長的影響，從中選出最優的3個水平進行正交實驗。結果表明，野生多孔菌菌絲的最適生長條件為:碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH7.0、培養溫度為35℃。本研究為野生多孔菌資源的開發利用提供了理論依據。

關鍵詞:多孔菌;生物學特性;ITS

序列分析多孔菌(polypore)是高等真菌的一個類群，該類群真菌子實層體呈孔狀、質地為革質至木質［1］。多孔菌廣泛分布于各種類型的森林中，目前在我國已知的多孔菌有704種。多孔菌除了在生態生態系統中發揮重要的生態功能外，很多種類本身具有良好的經濟價值，如藥用多孔菌靈芝(Ganodermalucidum)、云芝(Coriolusversicolor)、樺褐孔菌(Inonotusobliquus)、茯苓(Wolfiporiacocos)、桑黃(Inonotussanghuang)、豬苓(Polyporusumbellatus)等，已被證實具有調節增強人體免疫力、抗腫瘤、降血壓及降血脂等功效［2－5］。有些多孔菌如灰樹花(Grifolafrondo-sa)、疊生干酪孔菌(Oligoporusobductus)等，因營養豐富，蛋白質含量較高，具有很好的食用價值［6］。此外，有些多孔菌產生的木質素分解酶，如漆酶(Lacease)、錳過氧化物酶(Manganeseperoxidase)、木質素過氧化物酶(Ligninperoxidase)，被廣泛應用于食品工業、生物修復、紙漿漂白和環境治理等領域［7－9］。因此，對野生多孔菌的采集分離和應用研究，具有重要的經濟價值和開發前景。本研究將利用從連云港市海州區許莊村采集的野生多孔菌子實體為試材，分離獲得其菌絲體并對其進行生物學特性和分子鑒定研究，為保護野生多孔菌生物多樣性及資源的合理開發應用提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1供試材料1.1.1供試菌株野生多孔菌采自江蘇省連云港市海州區許莊村,供試菌株為野生分離。保藏于連云港市農業科學院生物技術中心，編號DK1。轉接到PDA培養基上活化，用于后續試驗。1.1.2供試固體培養基基礎培養基:葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。碳源實驗培養基:碳源20g、蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。氮源實驗培養基:氮源3g、葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L，pH自然。pH實驗培養基:葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，調節pH。溫度實驗培養基:葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。

1.2方法1.2.1菌種活化在超凈工作臺上將保存的野生多孔菌菌株轉接至基礎培養基中進行活化培養。1.2.2ITS序列分析菌絲體總DNA提取利用DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，北京)。以真菌通用引物ITS1(5＇－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3＇)和ITS4(5＇－TCCTCCGCTTATTGGATATGC－3＇)為引物進行PCR擴增，體系采用50μL體系(10×TaqBuffer，3μ;dNTP，4μ;ITS1，2μ;ITS4，2μ;DNATaq聚合酶，1μ;基因組DNA，3μ;ddH2O，33μ)，反應條件為:94℃，2min;94℃，30s;56℃，30s;72℃，30s;30次循環，72℃，10min。獲得的PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠檢測。引物合成與PCR產物測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。測得的ITS序列通過BLAST軟件進行同源序列比對，構建系統發育樹。1.2.3碳源試驗分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎培養基中的葡萄糖，121℃滅菌20min后倒入9cm培養皿中，每個培養皿裝培養基15mL，待培養基凝固后，用打孔器(直徑8mm)在菌種菌落邊緣取接種塊分別接種，每個處理5個重復，接種后置于25℃恒溫培養箱中進行黑暗培養。自接種后48h開始，采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察并記錄菌絲長勢。1.2.4氮源試驗分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎培養基中蛋白胨，實驗方法同1.2.2。1.2.5溫度試驗將接種后的平板培養皿分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃不同溫度條件下培養，每個處理5個重復(培養基為基礎培養基)，實驗方法同1.2.2。1.2.6pH試驗用0.5047mol/L的鹽酸和0.5001mol/L氫氧化鈉溶液分別調各培養基初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，實驗方法同1.2.2。1.2.7正交試驗在以上單因素實驗的基礎上，選取各單因素實驗中中最優良的3個條件進行L9(34)正交試驗，實驗方法同1.2.2。

2結果與分析

2.1ITS序列分析經PCR擴增和序列測定，獲得供試菌株ITS序列片段，經Blast在線比對后，與相近種菌株構建系統發育樹(圖1)。系統發育樹表明，供試菌株DK1與硬毛栓菌(Trametestrogii)(EU790491.1)的相似性最高，達到100%。

2.2不同碳源對菌絲生長的影響實驗菌株在不同碳源下的生長情況見表1。以葡萄糖和麥芽糖為碳源時，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，但菌絲較為稀疏，其次為蔗糖，乳糖，可溶性淀粉為碳源時菌絲生長最為緩慢。2.3不同氮源對菌絲生長的影響實驗菌株在不同氮源下的生長情況見表2。以酵母浸粉為氮源時，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，且菌絲濃密，其次為蛋白胨，氯化銨以及硫酸銨為氮源時，菌絲生長速度相差不大，但菌絲較為稀疏。在以尿素為氮源的培養基上，實驗菌株菌絲未見萌發。2.4不同溫度對菌絲生長的影響野生多孔菌菌株在不同溫度下菌絲的生長情況見表3。實驗菌株在15～45℃溫度范圍內均能萌發生長，但在15℃條件下培養的實驗菌株菌絲生長速度明顯慢于其他溫度條件下培養菌絲。從菌絲長勢及生長速度來看，35℃更利于實驗菌株菌絲的生長。

2.5不同pH對菌絲生長的影響實驗菌株在不同pH下的生長情況見表2。菌絲在pH6～9.0的條件下均可生長，且多孔菌菌絲在不同pH下差異并不顯著。綜合比較，最適pH為7.0。2.6正交實驗對碳源、氮源、pH和溫度4個因素進行篩選，挑選出最優3組水平處理，選擇4因素3水平作L9(34)正交試驗(表5)。結果顯示，4種因素對多孔菌菌絲生長的影響為:溫度＞氮源＞pH＞碳源。綜合評價，野生多孔菌最佳生長條件是蔗糖、酵母浸粉、pH7.0、35℃。

3小結

硬毛栓菌(Trametestrogii)是一種廣分分布于世界各地的白腐擔子菌，目前的多項研究都已證實該菌可被用于工業染料的脫色［11］。在本研究中，通過ITS分子生物學鑒定，野生多孔菌菌株DK1與硬毛栓菌相似性最高，為100%。但該菌株是否為硬毛栓菌，還需進一步的形態學鑒定。通過單因素實驗以及正交實驗，最終確定野生多孔菌的最適生長條件為:碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH7.0、培養溫度為35℃。本研究為野生多孔菌菌株的進一步開發利用提供了理論基礎。

參考文獻

［1］周麗偉，戴玉成．中國多孔菌多樣性初探:物種，區系和生態功能［J］．生物多樣性，2013，21(4):499－506．

［2］林志彬．靈芝抗腫瘤作用的免疫學機制及其臨床應用［J］．中國藥理學與毒理學雜志，2015(29):865－882．

［7］潘忠成，賴娜，李琛，等．白腐菌在廢水處理中的應用研究進展［J］．化工技術與開發，2013(7):59－63．

［9］田野，劉鵬，楊秀麗．紙漿生物漂白的研究進展［J］．江蘇造紙，2010，41(4):27－32．

作者：楊和川 蘇文英 譚一羅 秦裕營 馬騰 浦漢春 周振玲 單位：連云港市農業科學院