泡菜中乳酸菌的抗菌性范文

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《中國調味品雜志》2014年第七期

1實驗方法

1．1乳酸菌的分離純化用無菌生理鹽水稀釋樣品（泡菜水＋部分菜葉）液于一定濃度，取以上稀釋液1mL于滅菌的MRS（加入了2％CaCO3）培養基中混勻，38℃培養48h。挑取平板底部和表面的、圓形或梭形的、有溶鈣圈的乳酸菌疑似單菌落，在MRS平板中劃線接種，38℃培養48h，平板純化4代，確認為純培養物后，對其進行革蘭氏染色、鏡檢觀察細胞形態、乳酸定性實驗［4］等，轉斜面，4℃保存。

1．2抗菌活性乳酸菌的篩選以大腸桿菌為指示菌，用牛津杯法測定以上各個乳酸菌代謝物的抑菌活性，測量抑菌圈大小，挑選出抑菌圈較大、較明顯的菌株。

1．3指示菌菌懸液制備將實驗室保存的3種指示菌活化后，分別接種于滅菌的普通肉湯液體培養基中，于38℃培養24h；將以上指示菌分別配制成（100～10－7）不同梯度的菌懸液，然后分別涂平板計數，測定其生長量。分離鑒定的產璞酵母接種于滅菌的YPD液體培養基中，于29℃培養24h。

1．4乳酸菌代謝產物的制備將分離鑒定的乳酸菌分別接種于MRS液體培養基中，于38℃培養48h，離心（4500r／min，15min），取上清液，在無菌工作臺，經細菌過濾器（0．22μm濾膜）過濾，收集濾液即為乳酸菌的代謝產物，用pH計測定其pH值，用電位滴定法測定其總酸度［5］（以乳酸計），然后取出10mL中和pH至7．0，將代謝物原液和中性代謝物放入4℃冰箱備用。

1．5乳酸菌菌體制備將1．2．4分離得到的菌泥，用0．85％的無菌鹽水洗滌，再離心（4500r／min，15min），如此重復3次，將最后一次得到的菌泥用0．85％的無菌鹽水振蕩搖勻，并調節生長量為107cfu／mL，4℃冰箱備用。

1．6指示菌最適生長量的測定抗菌活性測定［6］，用牛津打孔平板法，將融化的無菌水瓊脂倒入大小一致的無菌平皿中，每個平皿15mL，待凝固后，用滅菌的鑷子在每個平板的水瓊脂上均勻放3個無菌牛津杯，分別取生長量約為9×103，9×104，9×105，9×106，9×107，9×108，9×109cfu／mL的指示菌原菌液1mL，加入30mL融化的普通肉湯培養基中，充分搖勻，倒入平皿中（不能倒在牛津杯孔里），待凝固后用鑷子取出牛津杯，并在杯孔里分別加入0．2mL的各個乳酸菌代謝產物，于4℃冰箱放置6h［7］，以使代謝物充分擴散，然后于38℃培養24h，用卡尺量取抑菌圈直徑，取平均值。

1．7乳酸菌代謝產物抑菌性測定方法同1．2．6。采用牛津打孔法，分別取生長量約為9×106cfu／mL的各指示菌原菌液進行測定。

1．8乳酸菌菌體的抗菌性測定將1．2．7中的0．2mL乳酸菌代謝產物換成0．2mL生長量為107cfu／mL的各乳酸菌菌體原液，其余步驟不變。

1．9乳酸菌中性代謝產物的抗菌性測定方法同1．2．7。將0．2mL乳酸菌代謝產物換成0．2mL中和后的代謝產物。

2結果與分析

2．1pH值及總酸度測定由表1可知，四川泡菜中的具有良好抗菌活性的10株乳酸菌代謝物的總酸度為6．02～15．67，pH值為3．59～4．87，說明在泡菜發酵過程中，乳酸菌均產生酸類物質，且酸性較強。

2．2乳酸菌對不同生長量指示菌的抑菌效果指示菌為大腸桿菌。由表2可知，除乳酸菌L8，L9，L10外，其他絕大多數的乳酸菌在指示菌生長量為9×106cfu／mL時的抑菌圈最大、最明顯。所以，取指示菌的生長量為9×106cfu／mL時的原菌液作為測定乳酸菌抑菌活性的指示菌液。

2．3乳酸菌代謝產物抑菌活性與其酸度之間的關系由表3可知，除L7外，其他乳酸菌隨著總酸度的升高，其代謝產物的抗菌性逐漸增強，證明其代謝產物中的抗細菌物質主要是酸類物質；且同一乳酸菌對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抗菌性更強，對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抗菌性較弱；而對產璞酵母幾乎無抗菌性；L7對產璞酵母有一定抑制作用。從以上結果可以看出，L7代謝產物中除了酸類物質還有其他的抗菌物質，可能是酶或者過氧化物等。

2．4乳酸菌抑菌活性與代謝物及菌體的關系由表4可知，當乳酸菌代謝物被中和至pH7．0后，除L3、L7、L10以外，其他乳酸菌都不具抗菌性；L7對細菌的抑菌圈半徑也明顯減小，而對產璞酵母的抑菌圈半徑無明顯變化。由此可得，在乳酸菌L7的代謝物中，除了酸，還有其他抗菌物質存在；L3和L10的代謝物中也可能含有微量的非酸類抗菌物質。除L3菌體有微弱抗菌性以外，其余乳酸菌菌體都無抗菌作用，證明乳酸菌的抗菌性基本上來源于其代謝產物。

3討論

由于人體腸道中常見致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，且也是泡菜中經常易染的雜菌，故本實驗以它們為指示菌；且泡菜中經常出現產璞酵母的生長繁殖，造成生花現象，所以研究乳酸菌對其的抑制作用，有望改善泡菜的品質。經過實驗篩選得到1株對指示菌具有優良抗菌性的乳酸菌L7，經鑒定為植物乳桿菌［8］。除L7對產璞酵母菌有一定抗菌性以外，其余均無抗菌性。這主要是由于本次所得乳酸菌的抗菌性主要由其代謝物中的酸類物質起作用，而酵母菌可以在pH3．0～7．5范圍內生長，所以產璞酵母的耐酸性較好，如果其代謝物中含有除酸類物質以外的其他抗菌物質，例如酶類、過氧化物、細菌素［9］等，則可顯示對酵母較強的抑制作用。因此可以確定在L7的代謝物中存在酶類、過氧化物、細菌素等抗菌物質，或者其可以產生大量的新型生物防腐劑———苯乳酸。由于L3和L10的代謝物被中和以后還具有微弱抗菌能力，所以在L3和L7的代謝物中也存在除酸以外的其它抗菌物質。本次篩選得到的10株乳酸菌其代謝產物的抑菌效果與其酸度呈正相關性，酸度越大，其抑菌效果越明顯，即乳酸菌代謝物的抗菌性在酸性環境中發揮得更好。L7對致病菌和產璞酵母均有一定抑制作用，對提高泡菜品質起重要作用。乳酸菌菌體本身基本不具有抗菌性，而其抗菌性主要是由其代謝產物作用的，在發酵食品中怎樣合理利用乳酸菌代謝物的抗菌性有待進一步研究。

作者：楊婧尹禮國馬偉玲張文學單位：四川大學輕紡與食品學院宜賓學院四川大學錦江學院白酒學院