向日葵葉片生理生化分析范文

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《中國油料作物學報》2015年第六期

摘要:

為了明確向日葵對菌核病菌毒素的生理生化抗性機制，測定了粗毒素液體浸根處理后，不同抗性向日葵品種豐葵雜1號(FKZ1)和7101的葉片幾丁質酶、β－l，3－葡聚糖酶活性和丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸、木質素的含量及組織細胞膜透性的變化。毒素處理后，向日葵葉片幾丁質酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性，丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸、木質素的含量顯著提高，以上幾種物質除丙二醛外，抗病品種與感病品種相比升高的速度快，幅度大。同時毒素可顯著破壞植株細胞膜透性，抗病品種細胞膜的耐損傷能力強于感病品種。研究表明幾丁質酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性，可溶性糖、游離脯氨酸、木質素含量和細胞膜的耐損傷能力與向日葵對菌核病的抗性呈正相關，丙二醛含量與向日葵對菌核病的抗性呈負相關。

關鍵詞:

向日葵;菌核病;毒素;生理生化

草酸是菌核病菌分泌的有毒代謝物，早在1886年，deBary［1］便認為草酸毒素與菌核病菌的致病性有關，其在感病的胡蘿卜組織中檢測到草酸鈣。Noyes等［2］在對向日葵核盤菌的致病性研究中發現感病的向日葵葉片中草酸含量是健康葉片的1．5倍。吳純仁等［3］通過掃描電鏡觀察證實了草酸對油菜菌核病的致病作用。劉秋等［4］報道向日葵菌核病菌在離體、活體培養條件下均能產生草酸毒素，該毒素對種子萌發、胚軸伸長和幼苗生長等都有毒害或抑制作用。目前，草酸作為菌核病菌分泌的毒素，被認為是菌核病致病的決定因子［5，6］。據報道，外源草酸可誘導油菜體內與防衛反應有關的酶的活性變化，這些酶活性的變化與草酸的致病機制和油菜的抗病機制有密切的關系［7］。前人在油菜和大豆等作物上對草酸毒素產生的培養條件［8］、致病性［9］、致病機制［10］、寄主的抗病機制［11］都有很多研究。關于向日葵菌核病僅見有關毒素產毒條件及生物測定方法的報道［12，13］，而對于向日葵核盤菌產生的草酸毒素對寄主的生理影響和品種的抗病機制等方面研究較少。因此本研究通過對向日葵抗、感品種經草酸毒素處理前后幾種酶活性、生化物質含量的變化以及細胞膜透性進行測定，探討向日葵生理生化方面的抗病機制，為選育抗病品種、有效控制向日葵菌核病提供理論基礎和科學依據。

1材料與方法

1．1品種及菌株向日葵品種為豐葵雜1號(FKZ1，抗病)，7101(感病)［14］，由黑龍江省農業科學院植物保護研究所免疫室提供。向日葵核盤菌菌株YS1，2013年田間采集并分離純化培養。

1．2培養基PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL，121℃高溫濕熱滅菌30min。PD培養液:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，121℃高溫濕熱滅菌30min后備用。

1．3粗毒素的制備將菌株YS1接種于PDA培養基平板上22℃培養2～3d，用打孔器取直徑1cm帶有菌絲的小塊移入裝有100mLPD培養液的250mL三角瓶中，22℃恒溫振蕩培養10d后，用雙層紗布過濾產毒培養液，所得濾液再用濾紙過濾一遍，濾液經高壓滅菌即為粗毒素，4℃冰箱貯存待用。

1．4草酸毒素的測定方法首先將粗毒素用無菌水定容到100mL，充分混勻后，取50mL粗毒素于三角瓶中，加50%CaCl2溶液1mL，加熱5～10min，放置24h，待其充分沉淀后，將溶液1600×g離心10min，棄去上清液用無菌水反復沖洗后，將沉淀溶于5mLH2SO4中(水∶硫酸=9∶1)，待沉淀充分溶解后，將溶液移入滴定瓶中，加入1mL10%MnSO4溶液，加熱到65℃，用1．58g/LKMnO4滴定該溶液，直至顯出玫瑰色，并且幾秒內不褪色，計算草酸含量(1mL1．58g/LKMnO4相當于0．145mg草酸H2C2O4)［15］。本試驗草酸濃度為0．0036g/L。

1．5取樣及生理指標測定方法將在無菌土中培養長至六葉期的豐葵雜1號和7101的向日葵幼苗移入裝有草酸毒素的試管中，每處理每品種各取8株長勢一致的幼苗，每試管1株，置4000Lux、25℃光照培養箱中培養，光照時間16h/8d，以無菌水處理的幼苗為對照，分別在處理0、12、24、36、48、60、72h摘取毒素處理和對照處理的向日葵第一片真葉［16］，采用DNS還原方法測定幾丁質酶和β－l，3－葡聚糖酶的活性［17］;采用TBA反應法測定丙二醛含量［18］;采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量［19］;采用冰醋酸反應法測定木質素含量［20］;采用茚三酮試劑法測定游離脯氨酸含量［21］;用相對電導率測定細胞膜透性［22］。

1．6數據統計分析采用DPSv7．05版統計分析軟件，按照單因素隨機設計的方差分析模型，用Duncan氏新復極差法對同一時間不同處理的數據進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2．1毒素對葉片幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的影響向日葵不同品種經毒素處理后，葉片中幾丁質酶活性發生明顯變化(圖1)?？共∑贩N豐葵雜1號葉片幾丁質酶活性變化趨勢為先顯著升高而后逐漸下降最后趨于平穩，幾丁質酶活性高峰出現在處理36h;感病品種7101的幾丁質酶活性在36和60h出現兩個高峰，2個向日葵品種的幾丁質酶活性都顯著高于對照。抗病品種豐葵雜1號的幾丁質酶活性在各取樣時間段均高于感病品種，說明毒素可誘導幾丁質酶活性增加的效應在抗病品種上更為突出。毒素處理后，2個向日葵品種β－1，3－葡聚糖酶活性都顯著高于對照(圖2)?？共∑贩Nβ－1，3－葡聚糖酶活性高峰出現在毒素處理36h，感病品種β－1，3－葡聚糖酶活性在36和60h出現兩個高峰，毒素處理36h，抗病品種和感病品種β－1，3－葡聚糖酶活性與對照相比分別增加了368．6%和248．6%。說明向日葵菌核病菌毒素可以誘導向日葵幼苗體內β－1，3－葡聚糖酶活性增加，抗病品種β－1，3－葡聚糖酶活性增加值顯著高于感病品種(P＜0．05)。

2．2毒素對葉片內丙二醛、木質素、可溶性糖和游離脯氨酸含量的影響毒素處理可導致2個向日葵品種的丙二醛含量都顯著高于對照(圖3A)。毒素處理36h，抗、感品種葉片內丙二醛含量分別達到峰值，豐葵雜1號丙二醛含量較對照提高26．4%;感病品種7101丙二醛含量較對照高出80．6%?？?、感品種之間相比，除在毒素處理12h丙二醛含量無明顯差異外，其它各時間段丙二醛含量均差異顯著(P＜0．05)，說明向日葵菌核病病菌毒素可以導致向日葵幼苗體內丙二醛含量的增加，且感病品種增加幅度大于抗病品種。毒素處理后抗、感品種木質素含量變化總趨勢為先升高后下降(圖3B)。毒素處理12h后，抗病品種木質素含量與對照相比差異不顯著(P＜0．05)，處理24h后，木質素含量顯著升高，當處理48h，抗病品種木質素含量達到峰值，與對照相比增加了156．6%，隨后逐漸下降，但顯著高于對照(P＜0．05)。經毒素處理的感病品種葉片組織內木質素含量在各時間段取樣均顯著高于對照，當處理48h，感病品種木質素含量達到峰值，與對照相比增加了155．9%。說明向日葵菌核病菌毒素可以誘導向日葵幼苗體內木質素含量的增加。向日葵不同品種經毒素處理后，葉片可溶性糖含量變化趨勢為先升高后下降(圖3C)。毒素處理12h后，抗病品種可溶性糖含量與對照相比差異不顯著，處理24h后，可溶性糖含量顯著升高，當處理36h，抗病品種可溶性糖含量達到峰值為4．973%，此時，感病品種的可溶性糖含量也達到峰值3．457%，與對照相比抗、感品種可溶性糖含量分別增加了124．7%和73．4%，抗病品種可溶性糖的增加量顯著高于感病品種(P＜0．05)。毒素處理后，2個向日葵品種的游離脯氨酸含量都顯著高于對照(圖3D)?？共∑贩N豐葵雜1號的游離脯氨酸含量在48h和72h出現2個高峰;感病品種7101的游離脯氨酸含量高峰出現在處理48h。2個品種相比較，各取樣時段抗病品種的游離脯氨酸含量都高于感病品種(P＜0．05)。

2．3毒素對葉片細胞膜透性的影響毒素對向日葵葉片細胞膜有明顯的毒害作用(圖3E)，毒素處理后2個向日葵品種的相對電導率都顯著高于對照(P＜0．05)。隨著處理時間的延長，電導率值隨之增加，對葉片細胞膜的毒害作用逐步加大。毒素處理后抗病品種的相對電導率一直低于感病品種，說明抗病品種細胞膜對毒素的耐受能力要強于感病品種。

3結論與討論

病程相關蛋白(pathogenesis－relatedprotein)是植物受病原菌侵染或不同因子刺激脅迫產生的一類誘導性蛋白質，其中幾丁質酶和葡聚糖酶被認為是在抗病過程較為關鍵的兩種防御蛋白。核盤菌菌絲細胞壁的主要成分是幾丁質和葡聚糖，能被幾丁質酶、葡聚糖酶水解，從而減輕病原菌對植物的侵害。張學昆等［23］發現，幾丁質酶以脫乙酰化幾丁質為底物時活性最高，而對乙酰化程度較高的幾丁質和菌核病菌細胞壁的活性較低，導致了油菜對菌核菌的抵抗力不高。張笑宇等［24］用黑痣病菌毒素處理馬鈴薯幼苗結果表明，黑痣病菌毒素誘導幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶活性升高，但幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶活性變化不是引起品種抗性差異的主要原因。這與本試驗結果略有不同，本研究結果表明向日葵經草酸毒素處理后，抗、感兩個品種體內的幾丁質酶和葡聚糖酶活性都顯著提高，抗病品種豐葵雜1號的幾丁質酶活性在各取樣時間段均高于感病品種，并且抗病品種β－1，3－葡聚糖酶活性增加值也顯著高于感病品種。所以筆者認為菌核病菌毒素可誘導幾丁質酶和β－1，3－葡聚糖酶活性增加的效應在抗病品種上更為突出。木質素在細胞壁中的積累可使細胞壁加厚，木質化作用可增加細胞壁的韌度，提高植物抗病原菌侵入能力;脯氨酸在植物體內除了起滲透調節作用外，還可提高蛋白質水溶性、穩定蛋白質結構，清除自由基等。本研究結果表明向日葵品種的抗病性與防衛反應活躍階段木質素和游離脯氨酸含量的增加有密切的關系，二者呈正相關關系。丙二醛是膜脂過氧化的最終產物，丙二醛的大量累積可對生物膜造成不可逆的損傷，加快病原菌對植物的侵染速度［25，26］。

臺蓮梅［27］研究了茄鏈格孢菌(nariasolani)毒素對馬鈴薯葉片丙二醛含量的影響，發現毒素處理馬鈴薯葉片后可明顯增加葉片內丙二醛含量，并且在感病品種上表現尤為明顯，這與本研究結果一致。本試驗表明經菌核菌毒素液處理向日葵葉片其體內丙二醛的含量顯著升高，感病品種丙二醛含量增加幅度大于抗病品種，進一步證明了菌核病菌毒素加速了細胞膜的損傷，使細胞內電解質泄漏劇增，葉片出現不可逆的損傷癥狀。關于寄主植物受脅迫后可溶性糖含量的變化與抗病性的關系已有許多報道，但在不同的病害中研究者得出的結論不一致。吳曉麗等［28］對花椰菜幼苗抗黑腐病生理機制研究表明幼苗接菌處理后抗病品種的可溶糖含量低于感病品種。李赤等［29］對富貴竹中可溶性糖含量與細菌性莖腐病的關系研究結果表明，寄主感染病原物后可溶糖含量與品種抗病性成正相關。本研究結果也表明，經向日葵菌核病菌毒素處理后，可溶性糖含量與向日葵品種抗病性成正相關。細胞膜透性的改變在一定意義上反映了細胞膜結構受損傷程度。本研究發現菌核病菌毒素可改變向日葵葉片細胞膜的透性，造成電解質外滲，并且隨著病菌毒素處理時間的延長，細胞膜透性逐漸增大，說明菌核病菌毒素對向日葵葉片細胞具有一定的破壞作用，這種破壞作用在感病品種上更為明顯。

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作者：劉佳 張勻華 孟慶林 石鳳梅 馬立功 李易初 左豫虎 單位：黑龍江八一農墾大學 黑龍江省農業科學院植物保護研究所