液相色譜串質譜檢測牙鲆魚過敏原范文

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摘要：以合成肽段ALTDAETK為定量特征肽段，SDFIEEDELK及LFLQNFAFSASAR為定性肽段，建立牙鲆中小清蛋白高效液相色譜-串聯質譜的檢測方法。同時對蛋白提取液、碘代乙酰胺濃度、酶/蛋白質比例、酶解時間在內的前處理條件和肽段質譜參數條件進行了優化。結果顯示：ALTDAETK肽段在0.005mg/L～10mg/L線性關系良好（R2>0.999），小清蛋白定量限2.74mg/kg；以大菱鲆為空白基質，重組小清蛋白的平均回收率為95%～102%，相對標準偏差（RSD）小于7%，重復性好。

關鍵詞：牙鲆；小清蛋白；高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）；過敏原；檢測

小清蛋白（Parvalbumin，PV）是水產品中的主要過敏原，在真骨魚類中廣泛存在，其對溫度、pH和變性劑都較為穩定，因此很多加工過的魚類產品的仍具有致敏性，魚類肌肉中小清蛋白的含量范圍為0～1.5mmol/L[1]，牙鲆的PV有3個亞基，本文只研究其中一個亞基G9I585（uniprot中PV編號），對其進行定性定量分析。“bottomup”[2]的蛋白質組學分析方法，其一般過程為：首先利用酶將目標蛋白酶切成小相對分子質量的多肽片段混合物，然后通過液相色譜串聯質譜（highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry/massspectrometry，HPLC-MS/MS）對特征肽段的檢測從而達到檢測蛋白的目的。此蛋白質分析方法的建立可以基于一個單一的特征肽，但最好每個蛋白質選2～3個肽，以獲得更好的特異性[3]，一般選用胰蛋白酶對蛋白質進行酶解，產生的肽通常C末端為精氨酸或賴氨酸，經ESI源離子化后主要產生帶有2個正電荷的離子，MS2碎裂時產生的子離子一般情況下為Y型離子帶有1個正電荷[4]。目前“bottomup”方法逐漸應用于牛奶[5]、雞蛋、魚類[6]、甲殼貝類動物[7]、堅果[8]、小麥、花生[9]和大豆等主要致敏原的檢測，相比于傳統方法酶聯免疫吸附測定（ELISA）[10]、聚合酶鏈式反應（PCR）[11]，對于真骨魚類PV的檢測，蔡秋鳳等[12-13]分別采用ELISA和western-blotting方法對不同加工方式的鰱魚的PV的含量變化進行分析，CARRERA等[6]利用LC-MS/MS方法對真骨魚的PV進行定性分析。LC-MS/MS方法具有準確、靈敏等特點，因此LC-MS/MS將作為一種重要的過敏原檢測方法。在LC/MS-MS過敏原檢測方法中特征肽段的篩選非常重要，特征肽段的篩選不僅要考慮所選肽段在酶解液中的質譜響應強度而且要考慮其獨特性[14]，一般用具有較強抗干擾能力及高通量的高分辨質譜對目標蛋白進行特征肽段的篩選[15]。樣品前處理過程包括蛋白質提取、酶解兩個部分，蛋白質的提取應盡可能的提取出更多的蛋白質以保證目標蛋白質被完全提取出來，酶解過程應使目標蛋白的特征肽段達到較高程度的酶解。本實驗中利用高分辨質譜進行特征肽段的篩選，選擇ALTDAETK、LFLQNFAFSASAR和SDFIEEDELK作為牙鲆PV的特征肽段，并對蛋白質提取液體和酶解過程的吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic，IAA）濃度、酶用量、酶解時間進行了優化，建立了以ALTDAETK作為定量肽段，LFLQNFAFSASAR和SDFIEEDELK作為定性肽段的牙鲆PV檢測的LC-MS/MS方法，可以實現對牙鲆中PV的精確定量。采用LC-MS/MS方法對牙鲆中PV的定量分析及對牙鲆PV的前處理優化過程未見文獻報道。

1材料與方法

1.1材料與試劑牙鲆、大菱鲆，購自山東青島。LTDAETK（847.9g/moL，簡稱ALT），SDFIEEDELK（1224.3g/moL，簡稱SDF），LFLQNFAFSASAR（1253.4g/moL，簡稱LFL），SDFIEEDELK（605.8g/moL，簡稱sdf）、重組PV（11645.0g/moL）委托上海sangonbiotech公司合成（純度＞95%）；測序級胰蛋白酶，瑞士Roche公司；二硫蘇糖醇（DTT），北京Solarbio公司；吲哚-3-乙酸（IAA），北京Solarbio公司；RapigestSF，美國Waters公司；Tris（分析純），北京Scientan公司；甘氨酸（分析純），北京Solarbio公司；EDTANa4（分析純），天津Kermel公司；乙腈（色譜純），德國Merck公司；甲酸（色譜純），德國Fluka公司。

1.2儀器與設備液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀（1200/6430），美國Agilent公司；超高效液相色譜四級桿靜電場軌道阱質譜聯用儀（UPLC-Q-ExactiveFocusMS），美國ThermoScientific公司；BEH-C18色譜柱，美國Waters公司；水平振蕩器（HS501），德國IKA公司；高速冷凍離心機（CR21G），日本HITACHI公司；調速型迷你離心機，上海sangonbiotech公司；超純水裝置（Mill-Q），美國Millipore公司；水浴鍋（HH-1），國華電器有限公司。

1.3方法1.3.1重組PV的酶解前處理：取10μL重組PV水溶液（8μg/mL），加入90μLRapigestSF（0.1%，體積分數），加入30μLIAA（5mmol/mL）溶液，40℃避光水浴30min；加入20μL胰蛋白酶溶液（0.1mg/mL），加入水使酶解液體積達到198μL，酶解14h，加入2μL甲酸終止酶解，120000r/min離心30min后，取上清；進UPLC-Q-ExactiveFocusMS檢測。1.3.2樣品前處理條件優化提取：新鮮牙鲆取肌肉打碎，取1g（精確至0.01g）樣品，加入10mL蛋白質提取液3（0.1mol/LTris，0.5mmol/L甘氨酸），水平震蕩30min，120000r/min離心30min后，取上清；上清液于100℃水浴鍋中加熱5min，120000r/min離心30min取上清。酶解：取10μL上清液，加入90μLRapigestSF（1mg/mL），按酶/蛋白質質量比2:5加入胰蛋白酶溶液（0.1mg/mL），加入水使酶解液體積達到198μL，酶解12h，加入2μL甲酸終止酶解，120000r/min離心30min后，取上清；待LC-MS/MS上樣分析。1.3.3UPLC-Q-ExactiveFocusMS條件色譜柱：EC-C18色譜柱（100mm×3mm，1.7μm）；柱溫：35℃；進樣量：5μL；流動相A：含1%甲酸的水溶液；流動相B：含1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15min，97%～70%A；15～18min，70%～100%A；18～22min，0%A；22～22.1min，0～97%A；22.1～25min，97%A；流速0.3mL/min。質譜條件：帶有加熱器的電子噴霧電離源（HESI），輔助氣體加熱器溫度為300℃；毛細管電壓，3500V；毛細管溫度為320°C；正模式的電噴霧電壓設置為3500V；掃描模式，FullMS+ddMS2正離子模式數據非依賴型掃描，其中FullMS的分辨率為70000，掃描400～1400m/z，DD-MS2確認模式分辨率17500，四極桿的碰撞能量介于10和30eV之間。使用MaxQuent軟件[16]進行數據處理，牙鲆PV的氨基酸序列用作fasta文件。1.3.4LC-MS/MS方法的建立色譜柱：BEH-C18色譜柱（100mm×2.1mm，2.7μm）；柱溫：35℃；進樣量：10μL；流動相A：含1%甲酸的水溶液；流動相B：含1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～13min，97%～70%A；13～18min，70%～40%A；18～19min，40%～0%A；19～21min，0%A；21～22min，0～97%A；22～24min，97%A。流速0.2mL/min。質譜條件：離子源，電子噴霧電離源（ESI）；毛細管電壓，3500V；霧化氣壓力，275.9kPa；干燥氣溫度，300℃；干燥氣流速，12.0L/min（氮氣）；采集模式，多反應監測（MRM）模式。

2結果與分析

2.1特征肽段的選擇重組PV酶解液經高分辨質譜檢測，其數據經MaxQuent軟件處理，從而得到酶解肽段的響應及得分（表1）。根據肽段穩定性和質譜檢測的要求，特征肽不應含有易氧化氨基酸半胱氨酸（C）和蛋氨酸（M）且長度在8到18個氨基酸之間[15]，LFLQNFSASAR、ALTDAETK、SDFIEEDELK滿足要求，因此選擇這三個肽段作為特征肽段。CARRER等[6]將LFLQNFSASAR等19種作為鑒定真骨魚的肽段，沒有將ALTDAETK、SDFIEEDELK作為鑒定真骨魚的肽段。為了確定肽段的獨特性，3個特征肽段在UniProtKB數據庫中進行序列對比，結果顯示，SDFIEEDELK為牙鲆特有肽段，而LFLQNFSASAR和ALTDAETK兩個肽段在三文魚、鯉魚、鱈魚、鱸魚等多種真骨魚中含有。用LC-MS/MS方法對三文魚和鯉魚肌肉樣品進行檢測，沒有SDFIEEDELK檢出，LFLQNFSASAR和ALTDAETK均有檢出，與數據庫檢索結果一致。

2.2前處理方法優化首先對提取液優化進行優化，以提取液所提取的總蛋白質濃度進行比較分析；其次在重組PV的酶解方法（見1.3.1）基礎上對IAA濃度、酶用量、酶解時間4個酶解條件依次進行單因素水平的優化，以肽段在儀器上的相對響應進行比較分析。2.2.1蛋白質提取液的優化在WU等[17]的牙鲆PV提取液1的基礎上進行提取液的優化，優化的三種蛋白質提取液分別為：蛋白質提取液1：Tris（0.1mol/L），甘氨酸（0.5mmol/L），DTT（1mmol/L）；蛋白質提取液2：Tris（0.1mol/L），甘氨酸（0.5mmol/L），DTT（1mmol/L），EDTA（5mmol/L）；蛋白質提取液3：Tris（0.1mol/L），甘氨酸（0.5mmol/L）。提取液1、2、3所提取的總蛋白質濃度分別為1.49mg/mL、1.18mg/mL、0.94mg/mL（蛋白質濃度由BCA方法測得）。由圖1可以看出ALT、LFL2個肽段的相對響應為提取液3>提取液2>提取液1，對于SDF肽段來說提取液3>提取液1>提取液2。提取液中的DTT作為一種還原劑，可以避免蛋白質中半胱氨酸之間形成分子內或分子間的二硫鍵，阻止蛋白高分子聚合物的形成提高提取效率[3]，但是在酶解過程中DTT也會對酶作用，抑制酶的活性導致酶解效率降低，從而質譜響應降低，因此經不含DTT的提取液3提取的樣品響應最高；從提取液1和提取液2比較來看，EDTA對蛋白提取效率沒有提高作用。綜合考慮選擇提取液3。2.2.2IAA濃度的優化進行IAA（5mmol/mL）用量的優化，IAA優化的3個水平分別為添加0μL、15μL、30μL，其結果如圖2所示，對于ALT、SDF肽段來說0μL>15μL>30μL，對于LFL來說30μL>0μL>15μL。肽段與IAA烷基化過程中發生的非特異性化學修飾[18]，這將改變標肽的質量，而肽的質量發生變化將導致該肽不能被MRM方法檢出到，因此測得的肽產率將低于實際產率；再者作為烷基化試劑的IAA可能對酶存在一定的抑制作用從而導致酶解程度下降，綜合考慮選擇酶解過程不添加IAA。2.2.3酶用量優化PV是一種鈣結合蛋白，具有由約30個氨基酸殘基組成的螺旋－環－螺旋蛋白模體的EF手圖像，每個EF手圖像（模體）結合一個Ca2＋，為小清蛋白提供了更加穩定的結構[1]，PV具有較高的酶解穩定性，因此本實驗設計的5個水平的酶/蛋白質比例高于一般的酶/蛋白質質量比例1:100～1:10[18]，酶/蛋白質質量的比例分別為1:10、1:5、2:5、3:5、4:5（提取液蛋白質濃度通過BCA方法側得）。酶用量優化結果如圖3所示，ALT與SDF肽段相對響應隨酶/蛋白質的比例增加而增強，但ALT肽段相對響應變化較為緩慢SDF變化較大，而LFL肽段相對響應隨酶/蛋白質的比例增加大致呈降低趨勢。不同的肽段由于其所在二級結構、自身性質及酶濃度不同其酶解效率而又差異，酶/蛋白質質量1:10～4:5，ALT肽段的酶解得量比較穩定，改變酶的濃度對酶解效果影響不大，可能已經達到較高程度的酶解；SDF肽段的酶解得量隨酶/蛋白質比例的增大而增大，說明此肽段還未達到完全或較高程度的酶解；LFL肽段可能由于酶解產物抑制或酶錯切造成其響應隨酶濃度增加而逐漸降低，綜合考慮以酶解得量比較穩定的ALT肽段作為定量肽段，以SDF、LFL肽段為定性肽段，酶/蛋白質質量的比例為2:5。2.2.4酶解時間優化分別選擇4h、6h、8h、10h、12h、14h6個酶解時間進行酶解時間的優化，如圖4所示。ALT、SDF、LFL3個肽段酶解12h后達到平臺期，因此酶解時間12h為最優，其總離子流圖如圖4所示。2.2.5酶解效率蛋白質的定量依賴于該蛋白質消化成的用作定量的目標肽段，而對于蛋白質的絕對定量方法的準確性取決于用作定量的目標肽段的酶解程度，若該目標肽段沒有達到完全酶解則會損害方法的準確性[19]，以優化的牙鲆樣品的最優酶解條件（酶/蛋白質質量的比例2:5，酶解時間12h），對1000mg/mL、500mg/L、200mg/L3個濃度水平的重組PV進行酶解，以ALT肽段作為定量肽段，以SDF與LFL肽段為定性肽段，ALT肽段酶解效率在104%～106%，滿足檢測要求。2.3LC-MS/MS方法質譜參數優化LFL定性離子對與CARRERA等[6]一致，其它肽段質譜參數沒有文獻報道，為了獲得最佳的質譜采集參數，對ALT、SDF、LFL、sdf4個合成肽段的前體離子、產物離子、碎裂電壓、碰撞能量等進行優化，優化結果見表2。

2.4線性關系與定量限以ALT肽段為定量肽段，SDF、LFL肽段為定性肽段，建立PV的檢測方法，在0.005mg/L～100000mg/L9個點線性范圍內，ALT質譜響應與內標sdf響應之比(y)與ALT濃度與內標sdf濃度之比(x)的線性關系為y=1.2211x+0.0133（R2>0.999）。小清蛋白定量限為2.74mg/kg。

2.5添加回收大菱鲆與牙鲆是同屬于鲆科的真骨魚類，經已經建立的LC-MS/MS方法檢測，大菱鲆中不含SDFIEEDELK、LFLQNFSASAR和ALTDAETK肽段。為了驗證牙鲆中PV含量檢測方法的準確性，選擇與牙鲆相近的物種大菱鲆為空白基質，以重組PV為標準品進行添加回收實驗，3個添加水平的平均回收率在95%～102%，滿足檢測要求，相對標準偏差3%～6%。

2.6實際樣品檢測采用大菱鲆為空白基質配制標準曲線對牙鲆進行檢測，檢測結果為ALT肽段含量為0.85mg/g，小清蛋白含量為11.72mg/g。

3結論

本實驗建立了以Tris（0.1mol/L）、甘氨酸（0.5mmol/L）為提取液，酶解過程中酶/蛋白質質量比例為2:5，酶解時間為12h的牙鲆中PV的前處理方法；以ALTDAETK為定量肽段，SDFIEEDELK、SDFIEEDELK為定性肽段的牙鲆PV的HPLC-MS/MS檢測方法，首次實現了用LC-MS/MS方法對牙鲆中主要過敏原PV的精確定量檢測。

參考文獻

[1]農小獻，賓石玉，蒙濤．等．小清蛋白研究進展[J]．生物技術通訊，2011，22（6）：887-891．

[3]詹麗娜，陳沁，古淑青．等．超高效液相色譜－四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜檢測食品中的牛奶過敏原酪蛋白[J]．色譜，2017，35（4）：405-412．

作者：葛敏敏 王建華 林洪 單位：中國海洋大學