森林微生物DNA提取研究范文

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作者：年士政單位：安徽省懷遠師范學校懷遠

在森林生態系統中,人們往往只注意到樹木及其林下植被,而對林下土壤中的微生物認識很少。誠然,與參天大樹相比,微生物的的確確微不足道,然而,微生物在森林生態系統中的功能性作用是任何人都不能忽視的。森林是微生物天然活動和繁衍的重要場所,微生物依賴植物而生存,同時微生物對森林乃至整個生態環境都有著重要的作用。試想,假如森林中沒有腐生型微生物,森林中的枯枝落葉將不能分解,地球也將成為一個大垃圾庫;假如森林中沒有共生型微生物,營共生生活的植物物種將無法正常生長,許多植物將會從地球上消失;缺少微生物,森林生態系統中的營養循環和能量循環就無法實現。當然,在森林生態系統脆弱條件下,微生物也會給森林帶來災害,如流行性病害。隨著人們對森林微生物的研究和認識的不斷加深,許多新的研究方法和技術也相繼得到了發展和應用。本文對dna分析技術在森林微生物學領域的應用和研究進展進行綜述,希望對廣大林業工作者有所啟發。

1森林微生物DNA分析技術

1.1DNA技術概述

DNA分析技術是在一系列分子技術的基礎上發展起來的,其中PCR(PolymeraseChainReaction)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)、AFLP(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)等技術是分子生物學技術的核心。以PCR技術(即聚合酶鏈式反應)為例,這一DNA分析技術是20世紀80年代末發展起來的一種快速體外基因擴增技術[1],原理是用于擴增位于兩段已知序列之間的DN段,在DNA聚合酶催化作用及引物存在條件下,連續進行高溫變性、低溫退火、中溫DNA合成這一循環。

1.2森林微生物DNA分析技術

在森林中,與參天大樹相比,微生物顯得非常渺小。由于微生物的/微觀0特征,使得林業工作者們在研究森林微生物時困難重重,尤其是對微生物資源的分類鑒定,因此在一定程度上阻礙了人們對微生物在森林生態系統中的功能性作用的了解和進一步認識。借助DNA分析技術,無疑有助于鑒定和從量化角度去研究這些微觀生命體。下面以森林真菌DNA分析技術為例,討論森林微生物DNA的提取、純化和分析方法。

1.2.1DNA的提取高等真菌DNA的提取,通常可以采用子實體/子囊果、孢子、擔孢子或菌絲體等作為起始材料,DNA的提取可以直接從細胞的破碎開始。但由于從林地里采取的樣品中,可能會混雜有植物材料,因此在進行DNA提取時要清除污染DNA,同時,還要考慮土壤及其它化合物的污染。鑒于真菌細胞壁結構特性,用于植物DNA的提取方法,需要根據情況做必要的修改和補充,才能取得較好的分離效果。真菌組織細胞和菌絲體細胞的破碎,通常采用液氮或干冰研磨。SDS(十二烷基硫酸鈉)細胞壁裂解技術是常用的方法之一,在擔子菌和子囊菌DNA的提取上十分有效[2]。另外,與植物DNA提取不同,對森林微生物細胞壁的破碎和DNA提取,通常不加細胞壁裂解酶,以避免目的DNA的降解;提取緩沖液中的EDTA濃度不宜過高,否則可能會影響核酸的活性。

1.2.2DNA的純化根據真菌類型和DNA分析的要求不同,對DNA需要進一步純化。DNA純化通常采用酚、酚氯、氯仿等溶劑反復抽提,以降解并除去蛋白質雜質。也可采用CsCl密度梯度超速離心法。CsCl密度梯度超速離心是根據各分離物質密度的不同而達到分離的目的。分離蛋白質的CsCl密度大約為1.2g#ml-1,RNA密度較大,約為1.8g#ml-1,DNA約在1.5~1.7g#ml-1,同時還依賴于嵌入DNA中的溴化乙錠(EB)的量。較理想的CsCl終濃度在1.57~1.62g#ml-1。除此以外,還可采用蛋白酶K消化蛋白質雜質,或加入核糖核酸酶RNase消化除去RNA雜質。許多與樹木共生的真菌,如豆馬勃(Pisolithusspp.)、樁菇(Pax-illusspp.)等擔子菌,多含有較高濃度的醛類物質,因此對這類微生物DNA的純化需要特別小心。

1.2.3DNA的分析對微生物DNA分析之前,首先要對DNA含量和純度進行評價。常用的評價方法有紫外分光光度法、熒光檢測法和EB染色法。瓊脂糖凝膠電泳法是微生物DNA分離鑒定和DNA純化的常用方法。這一技術可分離出其它方法無法分離的DN段,而且分離的片段范圍較廣,不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離出長度在200pb~50kb的DN段。用EB染色便于在紫外燈下觀察,有利于特定DNA條帶的回收。目前一般實驗室多采用水平板式凝膠電泳裝置。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,凝膠的密度取決于瓊脂糖的濃度。采用RFLP技術進行森林微生物DNA分析,是對含有特殊序列的DN段進行比較分析的常用手段。鑒于RFLP是對不同大小的DN段進行分析,因而對于帶有不同的核酸序列卻具有相近大小的DN段,用電泳的方法是不易區分開的,而DNA雜交技術可以顯著提高靈敏度。

1.2.4DNA雜交技術在對森林微生物進行菌種鑒定,研究菌種個體間或其他分類水平上的親緣關系,或進行環境檢測時,都要借助DNA雜交技術。DNA雜交是ssDNA分子間具有高度同源性的核苷酸序列間的結合。探針序列被標記,以用來檢測其與目的DNA結合的情況。采用35S或32P標記探針,經放射自顯影技術可以對雜交產物進行觀察和研究。在反應條件和探針選擇方面,要考慮到雜交條件的限制性及探針的選擇問題。

2DNA技術在森林微生物研究中的應用

2.1森林微生物的分類鑒定

由于森林微生物一般形體較小,結構較簡單,傳統分類學方法僅依賴于形態結構的描述,已很難保證分類的準確性和科學性,因而借助現代分子生物學手段可大大提高微生物的分類鑒定水平。在對森林微生物進行DNA分析時,需要根據微生物DNA結構的相似性和特異性,合成特異探針或引物。合成探針或引物的模板,可以是rRNA序列、染色體總DNA、rRNA基因的全部或非保守片段,甚至可以是rRNA基因保守區域及那些編碼蛋白質、木質素酶、纖維素酶或色素產物的基因。研究者們對多種植物和微生物的rDNA進行了測序分析,發現ITS和IGS片段具有較高的穩定性,菌物學家Gardes和Bruns等以ITS片段為模板,合成了多種引物(表1)[3],其中ITS1-F對真菌類特異性較高,可用于從混雜的植物或其它微生物類群的基因中將真菌區分開來,而ITS4-B對真菌中的擔子菌有很好的特異性。Erland等(1994)[4]采用引物CNL12(5p-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3p)和5SA(5p-CAGAGTCCTATGGC-CGTGGAT-3p)對外生菌根真菌TylosporafibrilloseDonk的rDNA進行了RFLP分析,該菌與其它外生菌根真菌具有顯著不同的RFLPs圖譜,因此可用于菌種的分離與鑒定。

2.2森林微生物多態性及親緣關系的研究

在研究微生物親緣關系時,通常用到DAN雜交技術。DNA雜交技術是建立在核酸堿基互補配對這一基本特性之上的。近些年來,在森林微生物研究中應用DNA分析技術,已取得顯著進展,尤其在森林病原菌和林木共生菌(包括固氮細菌和菌根真菌)方面成績斐然。Ry-giewicz等(1994)[2]研究了共生真菌DNA的提取和分析方法,使這一技術更趨成熟。Arm-strong等(1989)[5]從真菌子實體中提取DNA,然后采用限制性核酸內切酶對DNA進行酶切,得到的產物用于DNA的雜交研究,以揭示菌種間的親緣關系。Cummings等(1990)應用限制性片段長度多態性(RFLP)技術,對叢枝菌根真菌的遺傳關系進行了研究;Henrion等(1992)[6]對4種蠟蘑菌(Laccariabicolor、L.laccata、L.proxime、L.tortilis)的26個菌株的DNA分別進行PCR擴增,揭示出這些菌株在種間和種內存在多態性。研究發現,森林中常見的擔子菌雙色蠟蘑(Laccariabicolor),經過DNA提取和進行RFLP分析,如果采用完整基因雜交,放射自顯影對RFLP的觀察結果應與紫外觀察的一致;但如果用探針編碼一個從該菌中分離出來的特定基因,則在其染色體DNA的RFLP中通過放射自顯影僅能觀察到一條或幾條帶。在瑞典Karen等(1997)[7]通過對隸屬17屬的44種大型真菌rDNA的ITS區域進行CfoI,HinfI和MboI消化和RFLP分析,對真菌種間遺傳多樣性做了比較;并對部分菌種ITS序列進行了分析。Lobuglio等(1990)[8]對大型真菌土生空團菌(CenococcumgeophilumFr.)71個菌株的種內同源性及多樣性進行了研究,種間相似性的變化范圍較大(100%到44%),表明該真菌可能具有廣泛的遺傳多樣性,同時也表明,該真菌的分類學地位尚有待深入細致的研究,例如,從分子生物學角度可能會分出幾個不同的種來。

2.3展望

作為一門交叉學科的森林微生物學,在分別應用林學和基礎微生物學研究方法的同時,借助當代分子生物學技術進行發展,將對森林微生物學研究帶來無限生機。目前,林業微生物科學工作者在許多方面開展了有益的探索,尤其是在森林微生物分類鑒定、功能基因序列測定等領域取得了一定的成就。我們相信,分子生物學這一新興技術的不斷發展及其在生物學各學科的廣泛應用,對加深認識森林微生物的功能與作用、開發和利用森林微生物、改善森林生態環境、造福人類有著重要的意義。