集約化水產養殖論文范文

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1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗裝置膜生物反應器(MBR)處理水產養殖廢水的工藝流程如圖1所示。反應主體為圓柱形有機玻璃容器，有效體積為70L。膜組件為杭州捷濾膜分離技術有限公司生產的聚偏氟乙烯（PVDF）+特種納米材料材質的中空纖維膜，截留孔徑為0.1μm，中空纖維內徑為0.9mm，中空纖維外徑為1.5mm，膜面積為2m2，出水方式為負壓抽吸。正常運行時反應器采用間歇運行，每隔6h抽2h水。出水時間和停抽時間8min和2min。水力停留時間為8h。

1.1.2培養基（1）牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養基：5g牛肉浸膏，10g蛋白胨，1gKNO3，20g瓊脂，1000mL自來水，pH7.2～7.4。（2）硝酸鹽葡萄糖反硝化培養基：5g葡萄糖，2gKNO3，1gK2HPO4，1gKH2PO4，0.20gMgSO4•7H2O，1000mL蒸餾水，pH7.2～7.5。（3）DM培養基：4.70g琥珀酸，7.90gNa2HPO4•7H2O，1.00gKNO3，1.50gKH2PO4，0.30gNH4Cl，0.10gMgSO4•7H2O，2mL微量元素溶液。微量元素溶液：50gEDTA，2.20gZnSO4，5.06gMnC12•4H2O，5.50gCaC12，5gFeSO4•7H2O，1.10g（NH4）6Mo7O24•4H2O，1.61gCoC12•6H2O，1.57gCuSO4•5H2O，1000mL蒸餾水，pH7.0。

1.1.3檢測試劑（1）格里斯試劑（GriessReagent）Ⅰ和Ⅱ：試劑Ⅰ：將0.5g的對氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）加到150mL的30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。試劑Ⅱ：將0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加到50mL蒸餾水中，煮沸后，緩慢加入150mL的20%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。（2）二苯胺試劑：溶1.0g無色的二苯胺（Diphenylamine）于20mL蒸餾水中，然后徐徐加入100mL濃硫酸（相對密度1.84）中，保存于棕色瓶中。

1.2實驗方法

1.2.1活性污泥的培養馴化實驗所用的污泥為哈爾濱市文昌污水處理廠間歇曝氣池的活性污泥，其MLVSS/MLSS為45%，SV為34%，MLSS為5296mg/L。在活性污泥中好氧反硝化菌的富集馴化是通過MBR裝置馴化上述活性污泥。操作過程為瞬時進水（水產養殖廢水添加營養液配制而成）、曝氣、出水。曝氣期間，監測DO的濃度，保持DO濃度在2mg/L,溫度保持28~30℃，pH為7左右。進水COD值在250～350mg/L,氨氮值在20mg/L左右，MLSS值為350mg/L。好氧反硝化菌污泥的馴化富集過程采用的COD和氨氮濃度逐步提高的方法，最后達到COD800mg/L，氨氮70mg/L；曝氣時間從開始每個周期（24h）曝氣6h，逐步增加到8、12、18、24h，使系統逐漸適應，最后保持好氧狀態。為了加強好氧反硝化菌的優勢，每隔24h向培養液中加入適量5%硫酸銨溶液、5%硝酸鉀溶液和5%亞硝酸鈉溶液，培養60d。

1.2.2菌株的分離、純化與篩選取膜生物反應器中馴化60d的活性污泥10mL，經過充分打碎，用無菌水制備稀釋液，取稀釋倍數10-2、10-3、10-4稀釋液在牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養基平板上涂布，于30℃培養48h。挑取形狀各異的菌株純化數次，獲得36株菌株。將此36株菌株分別接種于裝有5mL的以硝酸鉀為氮源的反硝化培養基的試管中，反硝化培養基的試管中應放入一倒置杜氏發酵管，以檢測氣體的生成。試管置于30℃恒溫箱中培養。培養14d后，各取培養液5滴于白色比色皿上，加入格利斯試劑Ⅰ和Ⅱ各2滴，只有F20、F21、F28三株菌接種的試管中培養液（分別記為F20培養液、F21培養液、F28培養液，下同）呈紅色，說明培養液中的硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽，這3株菌具有好氧反硝化作用。再分別取這3支試管中培養液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺試劑2滴，F20培養液和F21培養液呈藍色，而F28未變色。說明F20培養液和F21培養液中仍有硝酸鹽未被轉化，F28培養液中沒有硝酸鹽；F28培養液中反硝化進行程度比F20培養液、F21培養液中反硝化程度高，F28菌株好氧反硝化能力較強。從而篩選獲得一株好氧反硝化能力較強的菌株F28。將菌株F28接種于硝酸鹽葡萄糖反硝化培養基斜面上擴大培養備用。

1.2.3菌株的鑒定從硝酸鹽葡萄糖反硝化斜面上挑取菌株F28，做平板劃線培養。待長出菌落后,觀察菌落的形狀、顏色等特征。采用革蘭染色,顯微鏡觀察其個體形態。另外,進行硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖發酵試驗、吲哚試驗、乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗、產硫化氫試驗、過氧化氫酶試驗等生理生化鑒定。并同時進行16SrDNA基因序列分析。使用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.BacterialDNAkit，購自美國Omega生物技術公司）提取F28菌株基因組DNA。對該菌的基因組DNA進行PCR擴增的引物采用27F：5''''-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3''''和1492R：5''''-GGTTACCTTGTTACGACTT-3''''。PCR反應體系(25μL)：2.5μL10×PCR緩沖液,3.5μLMgCl2，0.5μL模板DNA，0.5μLPF和PR，1μLdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，16μL超純水。PCR反應條件為：98℃5min；95℃35s，55℃35s，72℃1min，35個循環；72℃8min。得到的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序由上海生工生物工程有限公司完成。測序結果通過NCBI的BLAST檢索程序與GenBank中已知16SrRNA序列進行同源性分析。通過MEGA5.05軟件用NJ法構建系統發育樹。

1.2.4菌株的反硝化性能實驗從硝酸鹽葡萄糖反硝化斜面上挑取菌株F28接種于DM液體培養基中，200r/min、37℃搖床中培養，測OD600值，在OD600值0.4左右，按1%(V/V)接種量接種于DM液體培養基中，200r/min下恒溫振蕩培養3d，每隔2h測定培養液OD600值、培養液中硝酸鹽以確定菌株F28的生長情況和反硝化能力。

1.2.5菌株F28對水產養殖廢水的凈化效果采集集約化水產養殖車間水處理過濾裝置中的混合液，充分攪拌后，靜置，取上清液過濾，裝過濾液2L于5L三角瓶中。以5%（V/V）的接種量接種于上述污水中。每隔1d取樣測定培養液中COD、硝酸鹽、氨氮含量。

1.3分析方法硝酸鹽的測定用紫外分光光度法；氨氮的測定用納氏分光光度法；OD600采用分光光度計在600nm波長下，以未接種的培養液為參比，測量菌液的吸光度。COD的測定采用重鉻酸鉀法。

2結果與討論

2.1含好氧反硝化菌污泥的培養馴化經過60d的不斷調試,曝氣時間由開始的每個周期(24h)6h變為24h。活性污泥里的菌群以好氧菌為主。此時進水營養液的COD為800mg/L,氨氮為70mg/L左右。系統穩定，COD去除率在80%以上，氨氮的去除率在80%以上，總氮的出去除率在55%以上。馴化結果良好。

2.2菌種鑒定菌落呈圓形,乳白色，表面光滑。生理生化檢測表明，菌株F28革蘭氏染色反應呈陰性，硝酸鹽還原試驗、葡萄糖發酵試驗、檸檬酸鹽試驗、產硫化氫試驗、過氧化氫酶試驗呈陽性，淀粉水解試驗、吲哚試驗、乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗呈陰性。經過對菌株F28菌株DNA的提取及PCR擴增，得到了一定長度的DN段，16SrRNA的PCR擴增產物電泳照片見圖2。通過與左側的Marker對照，可知目標擴增產物的片段長度約1500bp。對菌株F28的DNA進行測序研究，得到長度為1442bp的16SRNA基因序列，將獲得的基因序列與GenBank數據庫中序列比對，結果表明，菌株F28與多株假單胞菌屬的菌株具有高度同源性，同源性均在99%以上,結合生理生化檢測推斷菌F28為Pseudomonassp。應用MEGA5.05軟件采用NJ法構建系統發育樹，確定其進化地位.結果如圖3所示。

2.3菌株的反硝化作用菌株F28在DM液體培養基上培養生長時，溶液中硝酸鹽濃度的變化曲線以及菌體生長變化曲線如圖4所示。由圖4可知，菌株F28延遲期內硝酸鹽濃度有下降，但反硝化過程主要發生在對數期，對數生長期時間較長。在穩定期和衰亡期之后菌量不再增加，并在后期略有下降，但仍具有較強的反硝化能力。F28的延遲期較長，為7h。當菌種接種到新培養基之后，需要經過一段時間的調整和適應，以合成多種酶和細胞其它成分。F28的對數期相對較長，約持續9h，反硝化主要發生在這個時期，這可能是因為對數期生長速率最大，細胞合成所需要的能量和還原力主要在這一階段被消耗，因此指數期是反硝化效率最高的時期。

2.4菌株F28對水產養殖廢水的凈化作用由表1可以看出，菌株F28對于集約化水產養殖廢水處理2d后，NO3--N、NH4+-N濃度由初始77.1mg/L、46.3mg/L分別降至7.4mg/L、1.59mg/L，去除率分別為90.4%、96.6%。同時，菌株對廢水中COD具有一定去除作用，處理2d后的去除率為33.7%。處理第3天基本上和第2天變化不大。因此，菌株F28在處理水產養殖廢水處理中具有相當好的效果，在實際工程應用中具有較大潛力。本研究針對MBR反應器處理水產養殖廢水系統，逐步提高反應器COD和氨氮的負荷，逐步增加活性污泥曝氣時間以至全時段曝氣，反應器內菌群以好氧菌為主，污泥馴化結果良好，系統穩定，MBR反應器的總氮的去除率在55%以上。經過稀釋、平板劃線分離純化與篩選，從MBR處理水產養殖廢水體系中獲得的適合水產養殖廢水處理的好氧反硝化菌F28。結合生理生化試驗和16SrRNA基因序列分析及同源性對比確定所篩得的菌株F28為一株假單胞菌（Pseudomonassp）。好氧反硝化細菌廣泛存在于自然生態系統中，目前分離出的好氧反硝化菌歸屬于多個屬，假單胞菌是主要的屬之一。從土壤、城市污水處理廠污泥中分離好氧反硝化菌常見報道。但適用于水產養殖系統的好養反硝化菌報道不多，李衛芬等從草魚養殖池水中分離出一株高效好氧反硝化作用的施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri），楊小龍等從富營養化的魚塘中分離出一株好養反消菌鑒定為不動桿菌屬(Acinetobactersp)。分離好氧反硝化菌的常規方法是根據Takaya等建立的有氧反硝化菌平板分離法。有氧反硝化菌平板分離方法是基于溴百里酚（BTB）培養基的指示劑溴百里酚藍在pH大于7.6時呈藍色，而細菌的反硝化過程伴隨著產堿，當平板培養基內有反硝化菌生長時，pH升高，菌落呈現藍色暈圈或者出現藍色。

全向春、李衛芬、楊小龍和姜磊等是基于有氧反硝化菌平板分離法進行好氧反硝化菌分離實驗。本實驗采用一種不同的高效分離好氧反硝化細菌方法。先使用牛肉膏蛋白胨固體培養基平板劃線法，將馴化良好MBR反應器中的活性污泥可分離細菌分離出來，分別接種于內置有杜氏發酵管的DM液體培養基中。培養12d后，用格里斯試劑溶液Ⅰ和Ⅱ檢測培養液中是否有亞硝酸鹽產生和觀察杜氏發酵管中氣泡的產生以及培養液變渾濁情況，用二苯胺試劑檢測培養液中硝酸鹽消耗情況。Takaya等建立的有氧反硝化菌平板分離方法，是間接利用堿指示劑篩選出好氧反硝化菌。與有氧反硝化菌平板分離法本實驗直接使用格利斯試劑Ⅰ及Ⅱ檢測有無亞硝酸鹽生成以及用二苯胺試劑檢測硝酸鹽更科學合理、準確度更高，且周期短，操作性強。對菌株F28反硝化作用研究，顯示其反硝化作用主要發生在細菌的對數生長期，隨著細菌快速增殖，硝酸鹽氮迅速下降，驗證了李衛芬等報道的，好氧反硝化菌反硝化特性主要發生在對數期。菌株F28對水產養殖廢水處理結果表明，24h時反硝化率去除率在70%以上；48h菌株對于水產養殖廢水中硝酸鹽、氨氮去除效果明顯，去除率均在90%以上，同時碳的去除率達到30%以上。文獻報道的適用于廢水處理系統的好氧反硝化菌對氮去除率達到82%，菌株F28對氮的去除效率更高，適用于水產養殖廢水處理。本研究分離出的適用于水產養殖廢水處理系統的好氧反硝化細菌F28，對氮有良好的去除作用，同時對碳有一定的去除作用。集約化水產養殖用水量較大，養殖廢水水質惡劣，利用生物方法處理水產養殖廢水循環利用是降低養殖成本、控制環境條件、保護生態環境的有效途徑。水產養殖廢水中氮含量對養殖對象具有較大毒害作用，研究工藝中好氧反硝化菌對于水產養殖廢水處理具有重要意義。菌株F28在水產養殖廢水處理特別是集約化水產養殖廢水處理實際工程應用中具有實際潛力與價值。

3結論

（1）利用MBR反應器，逐步提高反應器COD和氨氮的負荷，逐步增加活性污泥曝氣時間以至全時段曝氣，反應器內菌群以好氧菌為主，污泥馴化結果良好，系統穩定，MBR反應器的總氮的去除率在55%以上。（2）經過稀釋、平板劃線分離純化與篩選獲得了一株好氧反硝化菌F28，菌落呈圓形,乳白色，表面光滑。通過生理生化特性及16SrRNA基因序列分析及同源性比對，將菌株F28鑒定為假單胞菌中的Pseudomonassp。（3）研究菌株F28的硝酸鹽降解及生長曲線規律發現，菌株F28能夠有效去除硝酸鹽，24h時反硝化率去除率在70%以上。菌株F28的延遲期較長，說明該菌株適應新環境能力不強。同時其對數生長期較長，說明該菌在生長階段具有較強的反硝化能力的作用時間較長，硝酸鹽濃度在對數期大幅度降低。（4）菌株F28對于水產養殖廢水中硝酸鹽、氨氮有較好去除效果，在水產養殖廢水處理實際工程應用中有著積極的意義。

作者：郝兵兵羅亮戰培榮位瑩瑩姜再勝楊洪波單位：中國水產科學研究院黑龍江水產研究所上海海洋大學海洋科學學院上海海洋大學水產與生命學院