嵩草屬牧草休眠期內生細菌研究范文

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《草業學報》2016年第8期

摘要：

采用稀釋平板法從兩種嵩草屬牧草休眠期根和種子中分離到23株內生細菌，測定了其抑菌、溶磷、固氮和產IAA等生物學功能，并通過16SrDNA基因序列分析進行了鑒定。結果表明，兩牧草根和種子中內生細菌的數量和群落組成存在明顯差異；線葉嵩草內生細菌的種類比矮生嵩草豐富；矮生嵩草根部內生細菌比種子中豐富，而線葉嵩草種子內生細菌較根部豐富；種子存放時間影響內生細菌數量；20株可繼代培養內生細菌中具有抑菌、溶磷、固氮和產IAA生物功能的菌株分別占總菌株數的35％，55％，45％和25％。獲得15株內生細菌的16SrDNA基因序列，經同源性比較，其分別屬于芽孢桿菌屬、葉桿菌屬、葡萄球菌屬、類芽孢桿菌屬、微桿菌屬、原小單孢菌屬和鞘氨醇盒菌屬，且芽孢桿菌屬細菌為其優勢種群。

關鍵詞：

嵩草屬；內生細菌；鑒定；多樣性；生物功能

幾乎所有植物中都伴隨有內生細菌［1－2］，其與宿主植物在長期共同進化過程中形成密切關系，是植物微生物生態系統的主要成員［3］。隨著植物內生細菌研究的不斷深入，明確了其通過抑菌、溶磷和固氮等生物功能，增強了宿主植物的抗病性、抗旱性及生長競爭能力等［4－5］，成為近年來研究的熱點，特別是相關功能方面的研究報道較多。植物內生細菌可分泌吲哚乙酸（IAA）［6－7］，促進植物根的生長及分布，有利于從土壤中吸收更多的營養物質；內生固氮菌生活在植物體內，避免了化合態氮的抑制及土著微生物的競爭，表現出更高的固氮效率［8－9］；楊成德等［10］也從內生細菌中擴增出了nifH基因片段。關于內生細菌抑菌能力［11－17］和溶磷能力［7，11］方面的報道較多；另外，植物內生細菌具有激活植物基本抗病性或誘導植物系統抗病性的潛力［18］，還可以提高植物抗重金屬鹽的能力［19］；所以，植物內生細菌具有豐富的功能多樣性，是植物病害生物防治、內生固氮菌篩選及抗病性誘導等功能的天然菌源，也是研究植物與微生物互作的良好材料，具有極高的理論研究價值和實際應用價值，也具有開發為微生物源農藥或肥料的巨大潛力［20－21］。植物內生細菌的數量和種類存在豐富多樣性［22－23］，且在不同宿主及不同器官的種類、數量、群落結構和多樣性存在較大的差異［24－25］。矮生嵩草和線葉嵩草是高寒草地的多年生草本植物，草質柔軟，抗逆性強，營養價值高，為高寒草地的優良牧草。目前，關于高寒草地嵩草屬生長期內生細菌已有報道［6－7，15］，但是，有關休眠期種子及根系內生細菌方面的研究未見報道。因此，為了明確休眠期內生細菌的多樣性，本試驗從2種嵩草屬牧草種子及根系中分離純化其內生細菌，研究其種類及抑菌、溶磷和產IAA等功能，以期為明確2種嵩草屬牧草休眠期內生細菌的多樣性提供依據，也為高寒草地特有植物內生細菌的開發和利用提供依據。

1材料與方法

1．1試驗地概況

位于甘肅省天祝縣金強河甘肅農業大學高寒草原試驗站前金桿溝山麓兩側，北緯37°11′－37°18′、東經102°23′－102°47′，海拔2900～3200m，年均溫－0．1℃，全年大于0℃年積溫1380℃；無絕對無霜期，冷季長達7個月，植物生長季為120～140d，年降水量416mm，多為地形雨，集中于7－9月；10月底至第2年4月為降雪期；年蒸發量1592mm；植被主要為草本植物。

1．2試驗材料

供試內生細菌：分離自2011年11月進入休眠期的矮生嵩草和線葉嵩草的根系及2011年10月采集的種子，種子內生細菌分離時間為2011年12月和2012年12月。供試病原菌：馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌，均為甘肅農業大學植物病理實驗室保存菌種。供試培養基：肉汁胨培養基（NA）用于內生菌的活化和保存［26］；馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）用于植物病原真菌的培養和對峙試驗［26］；金氏（King）培養基用于菌株產IAA的測定；Pikovaskaia培養基（PKO）用于菌株溶解無機磷的測定；蒙金娜培養基用于測定菌株溶解有機磷的能力［27］；阿須貝無氮培養基用于固氮能力測定［28］。

1．3內生細菌的分離

將牧草的根和種子表面消毒，即對根用水沖洗干凈后稱取1g，在無菌條件下依次用10％NaClO浸泡3min，0．1％升汞浸泡10min，處理間均用無菌水沖洗3～4次；稱取1g種子，計算粒數后消毒方法同根。取最后1次無菌水沖洗液0．2mL涂布NA培養基，檢驗表面滅菌效果。將消毒后的材料置于無菌的盛有少量石英砂的研缽中磨碎（加入5mL生理鹽水），取上清液梯度稀釋到濃度為10－1～10－3，取3個稀釋度的菌懸液各0．2mL涂布于NA平板上，重復3次，置于28℃恒溫培養3～5d，根據菌落形態分類劃線純化，將純化后的菌種4℃保存于NA斜面上［29］。同時根據菌落數計算每g根和種子中的內生細菌總數及每粒種子帶內生細菌數，利用新復極差法進行顯著性分析。

1．4內生細菌的功能多樣性

1．4．1拮抗能力測定

采用平皿對峙法測定抑菌效果，即將經PDA培養基上活化的病原真菌打成直徑6mm的菌餅接種于PDA培養基平板中央，再將活化后的內生細菌點接于距菌餅2．5cm處，每平板接4點，以點接無菌水為對照，重復3次，置25℃恒溫培養箱中培養，對照滿皿后測量抑菌圈（cm）并計算抑菌率［9－10］。

1．4．2溶磷能力測定

將內生細菌接于Pikovaskaia培養基（PKO）或蒙金娜培養基平板上，每皿接5點，重復3次，置于28℃恒溫培養箱培養，觀察并測量菌株在培養基平板上形成的溶磷圈大小。根據溶磷圈直徑／菌落直徑（D／d值）確定內生細菌的溶磷能力［9－10］。

1．4．3固氮能力測定

經活化的供試菌株用無菌生理鹽水配制菌懸液，以200μL分別接種于阿須貝無氮平板（涂布）和液體培養基內，3次重復，以接種無菌水為對照，28℃培養（液體振蕩120r／min），在第3和7天目測其生長狀況，平板上有菌落和三角瓶內培養基變渾濁者為陽性［30］。

1．4．4產生IAA能力測定

標準曲線采用純3－IAA制作。將經King培養液培養12d的菌懸浮液和空白對照離心（4℃，10000r／min，10min），取上清液4mL加等量比色液，在黑暗中靜置30min，立即測定OD530值，重復測3次，以加比色液的空白對照調零。根據標準曲線計算出內生細菌分泌IAA的量［30］。

1．516SrDNA基因序列分析鑒定

內生細菌16SrDNA基因序列擴增引物序列為：引物1：5′－CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA－3′，引物2：5′－CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；擴增和檢測方法等具體參考文獻［9］進行，與GenBank數據庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih－gov／blast．cgi）中序列相似性比較，并用Clustal（1．8）軟件進行多重序列比較和用Mega（4．0）軟件鄰接法構建系統發育樹，確定其系統發育學地位。

2結果與分析

2．1內生細菌數量多樣性休眠期根內生細菌分離結果表明，矮生嵩草2011年根中內生細菌有3個種類，分別命名為ASG1、ASG2和ASG3，內生細菌總數為3．5×105cfu／g；線葉嵩草2011年休眠期根內分離到5種內生細菌，分別命名為XSG1、XSG2、XSG3、XSG4和XSG5，多于矮生嵩草，但內生細菌數為0．5×105cfu／g（表1），顯著低于矮生嵩草（P＜0．05）。矮生嵩草種子中2011年共分離到4種類型，分別命名為ASZ1、ASZ2、ASZ3和ASZ4，內生細菌數量為1．44×105cfu／g，低于根內，每粒種子帶菌數為1．12×102cfu／粒；2012年種子中內生細菌分離到3個種類，分別命名為2ASZ1、2ASZ2和2ASZ3，內生細菌總數為0．13×105cfu／g，每粒種子帶菌數為0．38×102cfu／粒（表1），顯著低于2011年（P＜0．05）。線葉嵩草種子中2011年分離得到4個種類，分別命名為XSZ2、XSZ2′、XSZ3和XSZ4，內生細菌數為22．27×105cfu／g，顯著高于根內數量，也顯著高于矮生嵩草（P＜0．05），每粒種子帶菌數為19．39×102cfu／粒；2012年種子分離得到4個種類，與2011年沒有變化，分別命名為2XSZ1、2XSZ2、2XSZ3和2XSZ4，內生細菌數為2．14×105cfu／g，每粒種子帶菌數為2．37×102cfu／粒（表1），顯著低于2011年，但顯著高于矮生嵩草（P＜0．05）。

2．2內生細菌功能多樣性

在所分離得到的23株內生細菌中，有20株可以進行繼代培養，并對其進行了抑菌、溶磷、固氮和產IAA功能測定。抑菌能力測定結果表明（表2），對馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌有拮抗能力的菌株所占比例分別為35％，25％和30％；對馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病抑菌能力最好的菌株均為XSG4，抑菌率分別為70．93％和75．00％，對馬鈴薯炭疽病菌拮抗能力最好的菌株為2XSZ4，抑菌率為79．36％，且拮抗菌株對其抑菌效果較其他2種病原菌好，抑菌率多在70％以上；對3種病原菌均有拮抗作用的內生細菌分別為XSG4、ASZ4、2XSZ3、2XSZ4和2ASZ2，占總菌株的25％，特別是XSG4對3種病原真菌的抑菌率均在70％以上，表現出良好的抑菌活性。對內生細菌進行溶磷、固氮和產IAA能力測定結果表明（表3），有9個菌株具有固氮能力，占總菌株的45％；5個菌株具有溶解有機磷的能力，占總菌株的25％，10個菌株具有溶解無機磷的能力，占總菌株的50％，XSZ2、XSZ2′、ASZ1、XSG1和XSG4同時具有溶解有機磷和無機磷的能力，占總菌株的25％，特別是XSZ2′對兩種磷溶解能力較強，XSZ3、ASZ2、ASZ4、ASG3、XSG2和XSG3具有溶解無機磷的能力，且溶磷能力較強；5株菌在含或不含色氨酸的培養基上均可分泌IAA，占總菌株的25％，其中ASZ2在含色氨酸的培養基上分泌IAA的量達4．52mg／L。

2．3內生細菌種類多樣性

20株可培養內生細菌中有15株成功提取其基因組DNA并擴增出16SrDNA序列。經16SrDNA序列相似性分析和構建系統發育分析（圖1），表明2種嵩草屬牧草分離到的內生細菌屬于7個屬8個種，且2XSZ2，2ASZ3和2XSZ4屬于芽孢桿菌屬，但種的分類地位有待于進一步研究，XSZ4和2ASZ1在屬水平的分類地位待定。7個屬分別為芽孢桿菌屬、葉桿菌屬、葡萄球菌屬、類芽孢桿菌屬、微桿菌屬、原小單孢菌屬和鞘氨醇盒菌屬，其中線葉嵩草中分離到5種，牧草內生細菌種類豐富，具有豐富的遺傳多樣性，但在不同牧草或器官種類有差別。在上述15個內生細菌中，6株屬于芽孢桿菌屬細菌，說明芽孢桿菌屬細菌為2種牧草內生細菌的優勢菌群。

3討論與結論

植物內生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應用潛力，是潛力巨大且尚待開發的微生物新資源。本文首次研究了線葉嵩草和矮生嵩草休眠期內生細菌在不同部位的多樣性，矮生嵩草2011年根中內生細菌總數為3．5×105cfu／g，種子中內生細菌數量為1．44×105cfu／g；線葉嵩草2011年休眠期根中內生細菌總數為0．5×105cfu／g，明顯低于矮生嵩草，種子中內生細菌數為22．27×105cfu／g，多于矮生嵩草，說明矮生嵩草根部比種子中內生細菌數量多，而線葉嵩草種子中內生細菌數量較根部多。Gagne等［31］曾認為由于大多內生細菌來源于根際土壤，所以根部的內生細菌含量最高，本研究中矮生嵩草與其觀點一致，但是線葉嵩草種子內生細菌數量比根部數量多，這可能與牧草種類及不同器官存在差異有關［24－25］。另外，矮生嵩草2012年種子中內生細菌數為0．134×105cfu／g，線葉嵩草2012年種子內生細菌數為2．14×105cfu／g，2種牧草種子內生細菌的數量均顯著低于2011年，說明種子存放時間影響其內生細菌數量。植物為內生細菌提供相對穩定的生存環境，而內生細菌可以通過抑菌、固氮、溶磷和產IAA等方式促進植物的生長。因此，利用內生細菌進行生物防治或作為生物肥料，較其他微生物制劑有顯著的優勢。本研究表明，嵩草屬牧草內生細菌存在著抗馬鈴薯壞疽病、馬鈴薯枯萎病和馬鈴薯炭疽病3種病原真菌的抗菌資源，可用于馬鈴薯貯藏期病害防治的潛力。牧草中還存在溶磷、固氮和產IAA的內生細菌，這些菌株可能對牧草獲得營養及抗逆方面具有重要的生物功能，且XSG4同時具有抑菌、溶磷、產IAA和固氮4種能力，ASZ4具有抑菌、產IAA和溶磷3種能力，ASZ2具有固氮、產IAA和溶磷3種能力，另外，有8株菌同時具有2種生物功能，這一結果表明內生細菌具有豐富的生物功能多樣性，也在生產中具有開發為微生物肥料或農藥的潛力。本試驗中多功能內生細菌XSG4和ASZ4屬于類芽孢桿菌屬的多粘類芽孢桿菌，ASZ2屬于芽孢桿菌屬，這兩個屬均為目前報道較多的內生細菌，且具有多種可利用的生物特性。如胡飛等［32］報道的多粘類芽胞桿菌DN－1對水稻紋枯病有較好防治效果；陳雪麗等［33］報道了多粘類芽孢桿菌BRF－1和枯草芽孢桿菌BRF－2菌懸液及其無菌代謝物不僅對黃瓜和番茄枯萎病具有較好的防治效果，且具有明顯的促進生長作用；郭芳芳等［34］報道的多粘類芽孢桿菌對番茄猝倒病具有較好的防治效果。本研究結果與其一致。

本研究首次對2種嵩草屬牧草休眠期內生細菌進行了16SrDNA序列分析，結果表明，高寒草地內生細菌在不同的植物間存在差異，在同種植物的不同部位也存在差異。線葉嵩草分離到5種內生細菌，矮生嵩草分離到6種，線葉嵩草根部分離得到的內生細菌與矮生嵩草根部分離到的種不同，但是兩牧草種子中分離到的內生細菌有兩種是相同的。2種牧草的內生細菌分為7個屬8個種說明嵩草屬牧草內生細菌具有豐富的多樣性，且芽孢桿菌屬細菌是2種牧草內生細菌的優勢菌群，與文獻報道一致［14，17，22－23］，這可能與芽孢桿菌屬細菌抗逆性強有關；另外，內生細菌中有3個菌株在種水平及2個菌株在屬水平的分類地位需進一步研究，說明該生境牧草內生細菌中有新的微生物種類。本研究中內生細菌所屬的7個屬中，只有芽孢桿菌是常見的內生細菌優勢種群，其他6個屬均為不常見屬，這可能與本試驗大多數菌株分離自高寒草地休眠期牧草根系和種子有關。本研究僅利用傳統培養方法進行內生細菌的培養，但許多研究已證實通過傳統的分離方法鑒定的微生物只占環境微生物總數的0．1％～10％［23］，不能充分展示微生物的多樣性狀況，且一部分植物內生細菌由于人工環境不適宜而不能進行繼代培養。因此，為了更全面地了解牧草內生細菌多樣性的真實水平及其物種組成，有必要利用非培養方法對其組織內未培養微生物進行研究。另外，本試驗僅利用16SrDNA序列分析方法對內生細菌進行了鑒定，還需利用生理生化試驗及（G＋C）％等進一步鑒定。

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作者:楊成德 王玉琴 陳秀蓉 張振粉 薛莉 王穎 姚玉玲 單位:甘肅農業大學植物保護學院