水體成組生物毒性評價范文

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《生態毒理學報》2016年第一期

摘要:

在淮河流域安徽段某區域采集了3個地表水樣和12個地下水樣，通過大型溞急性毒性(活動抑制)、微核及SOS/umu試驗，分析了這些水樣的急性毒性及遺傳毒性。結果表明，急性毒性測試中，該區域地表水及大部分地下水的急性毒性均未超過USEPA廢水排放毒性的控制要求(0.3TU)，有2個位點的地下水樣毒性當量為0.31TU，超過限值;經t-test分析，地表水的急性毒性顯著高于地下水。SOS/umu檢測中，2個地表水樣和7個地下水樣的結果呈陽性，表現出DNA損傷效應，其誘導率IR在(2.20±0.063)～(3.36±0.067)之間，對應的致癌風險P基本處在10-6～10-7水平。微核檢測結果表明，3個地表水樣具有較嚴重的染色體損傷效應，9個地下水樣表現為陰性。總之，該區域地表水急性毒性及遺傳毒性相對較高;部分淺層地下水也存在一定程度的急性毒性和遺傳毒性，致癌風險處在可接受范圍，但仍可能對周圍居民的健康產生潛在威脅;而深層地下水沒有檢測到任何毒性效應。研究為周邊居民飲水安全和人體健康提供了基礎信息。

關鍵詞:

大型溞;成組生物毒性;微核;SOS/umu;淮河流域

淮河流域水質的惡化和周邊癌癥的高發已使其水污染境況倍受關注，根據《淮河流域重點地區死因回顧性調查分析報告》中的結果，2006年，淮河流域部分區域總癌死亡率處于高發水平，特別是胃癌、肝癌、消化系統癌。基于此，有不少學者開展了相關研究，表明淮河流域居民飲用水中多環芳烴(PAHs)及鄰苯二甲酸酯等有機污染物含量超標[1]，酞酸酯類檢出率也很高[2]，主要無機污染物包括致癌物質亞硝酸鹽[3]，且當地居民長期飲用淺層地下水、飲用水井與水質已呈惡化的地表河流、河溝距離太近，受污染威脅的飲用水成為該地區腫瘤高發的重要因素[1]。淮河流域的這些特征污染物中，多環芳烴(PAHs)具有致癌、致畸、致突變的危害[4]，在國內外的飲用水標準中已有明確的控制要求;酞酸酯類是激素類污染物有遺傳毒性[5-7]。對于淮河流域的污染的研究已經開展了很多，但研究缺乏生物毒性的分析，而這對于從生物角度進一步評估水體的安全性就顯得非常重要。利用大型溞作為受試生物的毒性測試是一類非常重要的生物活體毒性測試，因其易于觀察，繁殖速度快，對毒性物質具有較高的敏感性等特點，被國內外廣泛應用于水體及化學品的毒性分析中[8]。其急性毒性(活動抑制)測試方法具有終點易于觀察，測試周期短，而且能反映出最明顯的有害影響的特點[9-10]，不僅在化學品毒性[11-13]、各類型工業廢水[14-15]生物毒性中開展了研究，也有不少研究集中在環境水體[16]、飲用水安全[16]等領域。微核及SOS/umu試驗屬于離體生物毒性測試技術，是兩類非常有代表性的遺傳毒性檢測方法。SOS/umu試驗以DNA損傷誘導umu操縱子表達作為檢測由終點，所以其可以檢測出由DNA損傷引起的遺傳毒性，已被列為ISO環境水樣及廢水遺傳毒性監測的標準方法[17]。微核試驗以染色體損傷的結構和數量變化作為檢測終點，所以其檢測的是染色體異常所引發的遺傳毒性[18]，兩者檢測的終點不同，反映的遺傳毒性作用機制也不同，可以互補。本研究利用大型溞活動抑制試驗、微核試驗和SOS/umu試驗對淮河流域某區域的地下水和地表水進行了急性毒性和遺傳毒性分析，研究結果為周邊居民飲水安全和人體健康提供了理論參考依據。

1材料與方法(Materialsandmethods)

1．1試劑和儀器4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO，Sigma)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、二氯甲烷、甲醇、丙酮(色譜純，美國DIMA)、胰蛋白胨(OXIOD)、羥乙基哌嗪硫磺酸(Sigma)、鄰硝基苯酚半乳糖苷(ONPG，Sigma)、RP-MI-1640培養基(Hyclone)、澳洲產胎牛血清(Gibco)、TK6人成淋巴細胞(美國ATCC)。氮吹儀(美國OrganomationAssociates)、人工氣候箱(上海一恒)、連續波長酶標儀(MultiskangoUSA)、CO2培養箱(上海博訊)、離心機(湖南湘儀)。

1．2樣品采集和處理

1．2．1采樣位點在淮河流域安徽段某區域設置15個采樣位點(見圖1)，S1、S2、S3為地表水;S4～S14為分散式淺層地下水，S15為深層地下水。采樣時間為2014年4月。

1．2．2水樣的富集用棕色玻璃瓶采集6L水樣，于在4℃保存，用0.45μm的玻璃纖維濾膜及真空泵進行抽濾，將抽濾后的水樣用活化后的HLB固相萃取小柱(6mL，500mg，watersoasis)進行濃縮，控制水樣的流速在6～8mL•min-1，并于48h內完成。同一水樣用3個小柱同時過濾，每根小柱最多富集2L水樣。富集完的HLB柱于-20℃保存待洗脫定容用。1．2．3水樣的洗脫和定容用6～10mL丙酮對抽干水分的小柱進行洗脫，洗脫至樣品為無色為止。將同一樣品的洗脫溶液合并，大型溞活動抑制試驗洗脫溶液用氮吹儀吹至丙酮的量小于0.6μL后，將其轉移到容量瓶中用標準稀釋液定容至600mL，同時丙酮含量在1‰以內。定容樣品作為毒性試驗備用。微核及SOS/umu試驗用氮吹儀吹至完全干燥，用DMSO定容，-20℃保存，待生物毒性分析備用。

1．3毒性測試

1．3．1大型溞活動抑制試驗方法參照USEPA毒性測試方法進行[19]，采用大型溞毒性測試試劑盒(歐陸科儀DAPHTOXKIFFTMMAGNA)進行試驗。具體方法如下:用標準稀釋水將濃縮水樣稀釋為5個濃度梯度(即10×，5×，2.5×，1.25×及0.5×)，以標準稀釋水為空白，每個濃度組設4個平行，每個平行放置5個出生24h內的幼溞，并以1‰丙酮做溶劑對照，于人工氣候箱20℃下暗光培養。根據抑制情況計算半數抑制濃度EC50，并按以下公式計算毒性當量(TU)[20]:TU=100%/EC50(%)(1)

1．3．2SOS/umu試驗試驗菌株選用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaty-phimurium)TA1535/pSK1002。首先對菌株進行復蘇和培養，將-80℃凍存的受試菌株TA1535/pSK1002緩慢解凍后混勻，吸取100μL原菌液加入到10mLTGA培養基中，于150～180r•min-1，(37±1)℃下振蕩孵育過夜。第2天用TGA培養液10倍稀釋，于37℃振蕩孵育1.5～3h。過程中以TGA培養基為空白對照，測定菌液在600nm處的吸光度值為0.25～0.30時，細菌達到指數生長期，將此時菌液作為暴露備用。暴露試驗參照ISO13829進行[17]。具體方法如下:試驗以500ng•mL-1的4-NQO作為陽性對照，以無菌水為陰性對照、以DMSO為溶劑對照，空白為無菌水(不含菌液)。在酶標板內用無菌水將水樣進行梯度稀釋，配置成6個暴露組(暴露量為0.8L，0.4L，0.2L，0.1L，0.05L，0.025L)，稀釋后體積為180μL，每個暴露組做3個平行;陽性對照組加入4-NQO180μL，終濃度為500ng•mL-1;溶劑對照組加入153μL無菌水和27μL30%的DMSO;再向以上各組每個測試孔內加入20μL10×TGA(胰蛋白10g，NaCl5g，羥乙基哌嗪硫磺酸11.9g，葡萄糖2g于100mL蒸餾水中，高壓滅菌后，加入50mg氨卞青霉素)，再加入70μL菌液，反應總體積為270μL。將酶標板于(37±1)℃，120～150r•min-1下振蕩培養2h。取另一酶標板，每孔加入270μLTGA培養基(同10×TGA，溶解于1000mL)，預熱至(37±1)℃;從上一培養板每孔中取30μL培養物至相對應的孔中，培養2h，在600nm下測定吸光度。取此培養物每孔30μL至已經加入120μLB-buffer的新酶標板中，迅速加入30μLONPG，混勻后于(28±1)℃振蕩培養30min后，再向每孔加入1mol•L-1Na2CO3酶反應阻斷液，在420nm處測定吸光度。結果的計算參照程龍鳳[21]的研究進行，按如下公式計算β-半乳糖苷酶活性U、生長因子G、誘導率IR、樣品的4-NQO當量濃度TEQ4-NQO(μg•L-1)以及致癌風險P。其中，S:樣品結果;B:空白對照結果;N:陰性對照結果;P:陽性對照結果。A420:菌液在420nm波長下的吸光度(顯色劑ONPG的顯色強度);A600:菌液在600nm波長下的吸光度(菌液濁度);致癌風險P計算中，按照調查區域實際情況取值，成年人體重按65kg計，每日飲水量按1.5L計。

1．3．3微核試驗參考相關學者測試方法，具體步驟如下[21]:首先將凍存的TK6細胞進行復蘇和傳代培養(培養基:RPMI1640培養基，再加入10%胎牛血清和雙抗(青霉素100Uint•mL-1、鏈霉素0.1g•mL-1)，使細胞濃度始終保持在2×105～1×106cells•mL-1之間。將待傳代的細胞按2×105cells•mL-1以每孔1mL的量加入24孔板中，培養24h。將受試水樣(地表水暴露量為0.03L，地下水為0.3L)加入培養液中繼續培養48h后離心收集細胞，加入1mL冷PBS(51mL的A液:二水合磷酸二氫鈉31.2g•L-1和49mL的B液:十二水合磷酸氫二鈉71.6g•L-1)洗滌細胞，洗滌2次;先后分別以1mL、500μL固定液(V甲醇:V冰醋酸=4:1)固定，吹散混勻;干燥后用Gi-emsa染液染色13min;經洗脫后用顯微鏡觀察計算微核千分率(MNC‰)和污染指數PI。污染指數PI=實驗組微核率-空白對照組微核率/陰性對照組的微核率(7)

2結果與討論(Resultsanddiscussion)

2．1大型溞急性毒性急性毒性分析結果表明(見表1)，淮河流域研究區的15個水樣，除5個未出現抑制，其余10個水樣都表現出不同程度的毒性。地表水中S2的毒性比較大，S3相對略輕;深層地下水樣S16在試驗中大型溞未出現任何抑制，水質安全;S4～S1411個淺層地下水樣中S13、S12、S7的毒性較大，居前3位;S6、S8、S9、S14未顯示出毒性。美國EPA廢水排放的毒性標準要求，排放水體的毒性當量應＜0.3TU(TU為毒性單位，TU越大表示毒性越大)，否則會影響受納地表水的安全，不允許排放[22]，以此保護對地表水。參考此限值分析，24h毒性試驗中，地表水3條河流的毒性當量均小于0.3TU，低于毒性限值。3條河流的毒性為S2＞S1＞S3，S1、S2水樣的毒性是S3的2.7倍。地下水檢測出毒性的7個水樣的毒性當量在0.035～0.22之間，以S13位點的毒性最高。48h毒性試驗中，3條河流的毒性當量也均小于0.3TU，但毒性均比24h要高，48h的毒性為S2＞S3＞S1，仍然是S2水樣的毒性最大，S1，S2的平均毒性略高于S3，為其1.04倍。地下水S13和S12位點的毒性當量為0.31，均已經超過限值，水體毒性效應比較明顯。根據相關研究報道S3所經村鎮癌癥死亡率相對比S2和S1所經村鎮的癌癥死亡率要低[21]。本研究結果基本表現為癌癥疾病高發區的毒性高于癌癥低發區。此外，研究在采樣時可見S1位點水質較差，發黑，并伴有輕微臭味，河岸兩邊可見大量垃圾堆放;S2采樣點河流主要用作運輸航道，據調查其早期水質很差，散發臭味，經常出現魚類死亡的現象，目前水質有所好轉。S3位點水質相對比較好，是當地的飲用水源地。由此可見，毒性分析結果與河流的水質情況也比較相符，表明受污染的水質確實產生了一定程度的毒性效應。從地表水與地下水的毒性均值t-test結果可見(見表2)，24h和48h的概率p值分別為0.038和0.002，均小于顯著水平(P=0.05)，表明地表水的24h和48h毒性與地下水存在顯著差異，即研究區地表水的毒性顯著高于地下水。淮河流域是我國主要的產糧區，流域內農業生產中施用的化肥農藥(N、P、有機毒物)、生活中產生的生活污水和垃圾(重金屬和難降解有機物)、以及畜禽養殖產生的污染物(氨)經地表徑流、降水、灌溉、農田排水等途徑進入并污染河流和地下水[23-24]。陳國良[25]對淮河流域的調查發現，安徽段面源污染問題是:部分農田用接納生活污水的溝渠水灌溉;生活垃圾隨意堆放;絕大多數農村都缺乏排水渠和污水處理系統，生活污水隨意排放，或直接排入河流。這些面源污染已成為流域地表水和地下水污染的主要來源，而降水會攜帶面源污染物進入水體，導致水體污染物增高，這種影響在施肥季節十分顯著[26]。基于以上分析，研究認為毒性很可能主要是由面源污染帶入水體的農藥、重金屬、難降解有機物、氨等有毒物質引起的。另一方面，雖然當地居民多以淺水井中的地下水為飲用水源，且淺層地下水的毒性雖然比地表水要輕，但受污染的地表水體很可能通過灌溉、滲透等水體交換的方式影響到周圍區域的淺層地下水水質[27]，從而對周邊居民的健康產生危害，而且這些淺層地下水本身也已經表現出不同程度的毒性反應。而研究結果顯示深層地下水在未表現出毒性，比較安全，且其受到地表水污染的可能性也小。

2．2SOS/umu試驗根據SOS/umu檢測結果分析(見表3)，S2、S3、S6、S10～S15共9個位點水樣的IR＞2，水樣呈陽性，表現出遺傳毒性。S11、S13和S2位點水樣遺傳毒性最大，其IR值分別為3.36±0.067、3.11±0.073、3.01±0.061，均遠大于2。地表水仍然是S2位點的毒性最大，相似的結論在之前學者的研究中也得到了證實[21]。12個地下水位點中有7個淺層地下水位點表現出遺傳毒性。由于SOS/umu試驗作為一類重要的遺傳毒性檢測方法，其檢測的是DNA損傷引發的遺傳學改變，針對的是不同類型的致突變物質[28-29]，所以以上結果表明這些位點的水樣存在能導致DNA損傷的致突變物質。另一方面，以致癌風險P分析，除地表水S2位點的致癌風險達到10-6，其余位點水樣的致害風險P均在10-7水平。美國EPA對于致癌物質的致癌風險要求控制在10-4～10-6可接受范圍，并以10-6作為評價標準[30-31]。由此分析，地表水S2位點達到美國對于致癌風險的控制的最低水平要求，但仍在可接受范圍內;其余位點均低于美國致癌風險的控制要求，因此認為雖然研究區超過一半的地表水和地下水在SOS/umu試驗顯示出遺傳毒性，但對人體的健康風險仍處于可接受的水平。

2．3微核試驗微核檢測結果表明，S1、S2、S3三個地表水樣顯示出較高的遺傳毒性(暴露量為0.03L)，均達到重度污染，其PI值均超過3.5，分別為4.06、4.56和6.11，其中S2位點水樣的遺傳毒性最大，其微核率達到41.00±2.08。地下水的遺傳毒性(暴露量為0.3L)比地表水明顯要輕，其中除S6為中度污染，S8、S11為輕度污染外，其余9個位點均未檢測出遺傳毒性，而且其PI值基本都在0.5以下。可見，地表水的暴露量僅為地下水暴露量的1/10，但是其微核檢測仍然表現出較高的遺傳毒性，說明地表水的污染危害比地下水更大。這與大型溞急性毒性以及SOS/umu試驗的檢測結果基本相符，尤其是S2位點，在3個試驗中均表現出較高的毒性。由于微核試驗與SOS/umu不同，其指示的是染色體損傷的結構和數量變化[32]。所以，研究認為地表水和部分檢測陽性的地下水中存在能引發染色體異常的污染物質，而且地表水的污染要更嚴重。

綜上所述，本研究結果表明，3個地表水體對大型溞急性毒性及致DNA損傷和致染色體異常的遺傳毒性均較高，尤其是S2位點最為嚴重。部分淺層地下水也檢測到一定程度不同類型的遺傳毒性，從致癌風險分析其還在可接受范圍，但是水體已經受到污染，可能對周圍居民的健康產生潛在威脅。同時，深層地下水在三類毒性測試中都表現為陰性，沒有檢測到任何毒性效應。因此，對于淮河流域安徽段的面源污染問題，以及地表水和地下水的污染情況應該予以重視。

作者：陰琨 趙淑莉 郭辰 呂占祿 王先良 金小偉 單位：中國環境監測總站 中國地質大學 中國環境科學研究院