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《浙江林業(yè)科技雜志》2014年第二期
1材料和方法
1.1試驗(yàn)材料和標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)樣本為2009年春季收集的不同產(chǎn)區(qū)的84個(gè)取樣點(diǎn)的龍井茶樣品，共527個(gè)。按照GB/T18650-2008的規(guī)定，其中西湖龍井一級保護(hù)區(qū)茶樣（XHLJ1）174份，來自一級保護(hù)區(qū)內(nèi)龍井村、梅家塢等10個(gè)自然村的27個(gè)取樣點(diǎn)；西湖龍井二級保護(hù)區(qū)茶樣（XHLJ2）56份，來自二級保護(hù)區(qū)的10個(gè)取樣點(diǎn)；錢塘龍井茶樣（QTLJ）137份，來自錢塘產(chǎn)區(qū)5個(gè)縣的20個(gè)取樣點(diǎn)；越州龍井茶樣（YZLJ）160份，來自越州龍井產(chǎn)區(qū)6個(gè)縣的27個(gè)取樣點(diǎn)。為減少樣品采摘期對龍井茶產(chǎn)地判別的干擾，從同一采樣點(diǎn)，收集采摘前期、中期、晚期的相同原料品種的龍井茶樣各1個(gè)，其中一個(gè)來自春茶開采后約第5天，一個(gè)來自開采后約第15天，另一個(gè)為第25天。樣本的原料品種為無性系品種龍井43（LJ43）和有性群體種（POPN）。兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和咖啡堿（Caffeine,CAF）等標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司。
1.2樣品測定稱取3.000g（粉碎）干茶樣，用50%甲醇室溫提取15min后過濾。殘?jiān)礈?次，合并濾液，定容到100mL。液相色譜分析采用安捷倫1100HPLC系統(tǒng)，4μmPhenomenexRP-MAXC12反相柱，型號規(guī)格為250mm×4.6mm，柱溫40℃；A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從4%B到25%B，流速1mL/min，洗脫60min，檢測波長280nm[25]。
1.3數(shù)據(jù)處理咖啡堿、C、EGC、EC、EGCG、GCG和ECG等組分通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比較確認(rèn)。其他未得到辨認(rèn)的酚性化合物和生物堿，通過比較保留時(shí)間和相對保留時(shí)間進(jìn)行匹配。去除掉一些不夠穩(wěn)定的小峰后，共保留26個(gè)HPLC峰用于分析。數(shù)理統(tǒng)計(jì)、主成分分析和線性判別分析采用SPSS軟件進(jìn)行；在線性判別分析中，對每類樣本采取隨機(jī)取二留一的方法劃分訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。
2結(jié)果與分析
2.1不同產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC化學(xué)圖譜相似度分析西湖龍井一級保護(hù)區(qū)（XHLJ1）、西湖龍井二級保護(hù)區(qū)（XHLJ2）、錢塘產(chǎn)區(qū)（QTLJ）和越州產(chǎn)區(qū)（YZLJ）4個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品的26個(gè)面積較大的HPLC共有峰的峰面積平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表1。SPSS的ONE-WAYANOVA檢驗(yàn)表明，在α=0.05水平下，不同產(chǎn)區(qū)龍井茶兒茶素等酚性化合物與生物堿HPLC含量在同一水平，沒有顯著性差異。4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC組份的歐氏距離見表2。從表2可以發(fā)現(xiàn)，XHLJ1和XHLJ2之間的歐氏距離最大，QTLJ和YZLJ之間的歐氏距離最小。4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC組份的歐氏距離和地理距離不一致，XHLJ1和XHLJ2之間的地理距離最近的，而歐氏距離卻最大。
2.2龍井茶的主成分分析對龍井茶的HPLC化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，共提取出5個(gè)主成分（表3），累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.2%，其中前兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為48%和23%（表3）。從表3可以發(fā)現(xiàn)，第一主成分（PC1）的構(gòu)成中，對主成分得分值影響較大的因子按系數(shù)大小降序?yàn)镋GCG、EGC、P11、C、CAF和EC，體現(xiàn)了幾種主要兒茶素單體成分的影響力；在第二主成分（PC2）的主要構(gòu)成中，影響大小依次為ECG、P20、CAF、P3和P16，主要包含的是一些洗脫時(shí)間較長的組分。以各樣本第一、第二主成分得分值分別作為X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)作圖（圖1），發(fā)現(xiàn)龍井茶按照品種的不同聚成兩個(gè)集團(tuán)，龍井43品種樣本（LJ43）主要位于左上方，而群體種樣本（POPN）主要位于右下方（圖1A），說明原料品種是影響龍井茶內(nèi)含成分關(guān)鍵性因素之一。但是，按照各樣本的第一、第二主成分得分值，未能將不同產(chǎn)地龍井茶分開（圖1B）。
2.3不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的線性判別線性判別分析首先將分析樣本分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集兩部分，先用訓(xùn)練集樣本建立判別模型，然后將訓(xùn)練集中的樣本每次輪流抽走一個(gè)后重新建模，來判定建立的判別模型的穩(wěn)定性，最后用驗(yàn)證集樣本來驗(yàn)證判別模型的適用性和正確率。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性判別分析，得到3個(gè)判別函數(shù)，其函數(shù)系數(shù)矩陣見表4。判別分析的結(jié)果表明（表5），117個(gè)西湖龍井一級保護(hù)區(qū)（XHLJ1）訓(xùn)練集的建模樣本中，106個(gè)分類正確，10個(gè)被劃分為越州龍井，1個(gè)被誤判為錢塘龍井；交叉驗(yàn)證的數(shù)據(jù)基本一致；而57個(gè)驗(yàn)證集樣本，49個(gè)判定為XHLJ1，8個(gè)判定為YZLJ。在西湖龍井二級保護(hù)區(qū)（XHLJ2）的訓(xùn)練集及其交叉驗(yàn)證中，均有三分之一左右的樣本被認(rèn)定成錢塘龍井（QTLJ），驗(yàn)證集中更有近一半的樣本被認(rèn)定成QTLJ。至于QTLJ，無論是訓(xùn)練集還是其交叉驗(yàn)證，或者是外部驗(yàn)證，都有20%~30%的樣本被分類成其他幾種類別。而YZLJ是判別正確率最高的一類，無論哪種情況，只有少量的樣本被判定到XHLJ1或QTLJ中。以各樣本的判別函數(shù)值作圖，在前兩個(gè)判別函數(shù)值FUN1和FUN2的投射平面（圖2A）上，XHLJ1位于左上，YZLJ位于左下，而XHLJ2和QTLJ重疊在右邊；在FUN1和FUN3組成的投射平面上（圖2B）可以看到，XHLJ1集中于最左邊的小塊區(qū)域內(nèi)，YZLJ則更靠右一點(diǎn)，而XHLJ2在右側(cè)集中于上部，而QTLJ較零落地分布在右下部。
3討論
由于不同加工工藝、原料嫩度對茶的品質(zhì)成分有很大影響，因此不同種類茶的HPLC圖譜有較大的差異性,往往比較容易進(jìn)行區(qū)分。而不同產(chǎn)區(qū)龍井茶及以龍井茶加工工藝制成的其他扁形茶，因其原料嫩度要求一致、加工工藝相同，其化學(xué)組成及HPLC圖譜的相似度很高,更難對同一茶類進(jìn)行產(chǎn)區(qū)判別。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)龍井茶在兒茶素、咖啡堿等化學(xué)成分的含量上沒有顯著性區(qū)別，而且HPLC圖譜的相似度高。進(jìn)一步的主成分分析結(jié)果表明，茶葉中最重要的幾類兒茶素單體是構(gòu)成第一、第二主成分的主要因子。根據(jù)前兩個(gè)組分得分值，相同原料品種的龍井茶樣本聚在一起。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證的就是這樣一個(gè)事實(shí)：由于遺傳基礎(chǔ)的不同，不同茶樹品種所具有的特有的生化成分比例，可以影響成品茶的品質(zhì)風(fēng)味。因此，為了得到穩(wěn)定的產(chǎn)品品質(zhì)和特色，除加工工藝外，鮮葉原料也應(yīng)該采用固定的茶樹品種或固定的品種搭配比例。這也說明，原料品種會對茶葉產(chǎn)區(qū)判別帶來較大的干擾。此外，從不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的歐氏距離結(jié)果可看到，地理距離最近的二級保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶與一級保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶之間的歐氏距離最大；而且在判別分析中，一級保護(hù)區(qū)與二級保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶之間沒有誤判。這一結(jié)果說明，在被研究的幾類茶產(chǎn)品中，二級保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶與一級保護(hù)區(qū)西湖龍井茶差異最大。相反，地理距離較遠(yuǎn)的越州龍井與西湖龍井一級保護(hù)區(qū)間的歐氏距離反而最為接近，兩者間的互相誤判也相對較多。對這一結(jié)果的解釋，僅僅考慮地域分布是不夠的，可能需要從歷史傳統(tǒng)和加工技術(shù)細(xì)節(jié)等各方面來加以分析。西湖龍井二級保護(hù)區(qū)歷史上幾乎都是生產(chǎn)旗槍茶的，20世紀(jì)90年代以后才開始轉(zhuǎn)產(chǎn)龍井茶，直到本世紀(jì)初才正式劃入西湖龍井產(chǎn)區(qū)。旗槍茶與西湖龍井茶外形比較相像，都屬于扁形茶，但旗槍更為細(xì)長一些，加工工藝上，都有“青鍋”和“煇鍋”兩個(gè)工序，但旗槍以前還有“挺鍋”工序。這兩類茶產(chǎn)品雖然挺類似，但風(fēng)格特征上仍然存在差異。這些工藝上的風(fēng)格和習(xí)慣，在轉(zhuǎn)產(chǎn)龍井茶并劃入龍井產(chǎn)區(qū)后，不可避免的還會有一定程度的留存和影響，因此可能是造成這兩個(gè)產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品之間存在一定差異的原因之一。而越州產(chǎn)品的龍井茶生產(chǎn)主要來自于上世紀(jì)90年代對西湖龍井歷史產(chǎn)區(qū)的學(xué)習(xí)和模仿，沒有歷史工藝的干擾和影響，因此可能在與西湖龍井一級保護(hù)區(qū)產(chǎn)品的區(qū)分上更為困難一些。本文采用代謝組學(xué)原理和模式識別技術(shù)研究了龍井茶4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品間的相似性和加以鑒別的可行性，雖然這一方法還不能正式用于茶產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別，但是在對于茶學(xué)研究中新思維和新技術(shù)手段的引進(jìn)，對于現(xiàn)在越來越多的茶葉地理標(biāo)志產(chǎn)品認(rèn)定科學(xué)依據(jù)的探索，都有良好的推動作用。
作者：王麗鴛成浩賀巍韋康張成才單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院