金釵石斛懸浮培養細胞生長研究范文

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《貴州師范大學學報》2016年第5期

摘要:

研究了培養溫度、培養時間、初始pH、搖床轉速對金釵石斛液體懸浮培養的影響。結果表明，在培養條件分別為培養溫度為25℃、培養天數為30d、初始pH為6、搖床轉速為120r/min時，金釵石斛原球莖增殖量最大，石斛堿的積累量也相對最高。

關鍵詞:

金釵石斛;懸浮培養;培養條件;增殖;生物堿

石斛屬是蘭科植物中較大的屬，全世界約有1100種，廣泛分布于亞洲、歐洲和大洋洲等地。目前供作藥用的石斛屬植物約有30多種。石斛的主要化學成分是生物堿、多糖、氨基酸、酚類、萜類、甾體及揮發油等［1］。在我國的傳統醫學中，石斛為常用貴重藥材，藥用歷史悠久，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效［2，3］，現代藥理學研究證明，石斛還具有降血糖［4］、抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力和擴張血管等作用［5，6］，石斛的藥理與其所含有的石斛堿密切關聯。金釵石斛作為貴州省四大主要中藥材之一，其資源的再生產對于我省中藥產業的發展至關重要。利用植物細胞培養技術生產藥用成分可以在人工條件下進行，通過操作培養條件和培養方式能極大地提高生產率，在較短時間內獲得大量的目標產物，既節省耕地，又解決了原料來源;既保護了生物多樣性，又可實現我國中藥資源的保護和中藥產業的可持續發展。本研究以金釵石斛為材料，對其在懸浮培養方面應用生物技術手段生產石斛堿有用次生代謝產物進行探討，得出適合石斛堿懸浮培養細胞生長和石斛堿積累的較佳搖瓶培養工藝條件，旨在對發酵罐中試放大培養石斛生產石斛堿提供研究基礎。

1材料及方法

1．1供試材料

金釵石斛采自貴州省赤水市旺隆鎮的野生金釵石斛，種子為野生果實，金釵石斛莖段為經馴化后移栽到貴州師范大學生命科學院溫室，以栽培存活2年后的莖段為外植體培養再生植株。

1．2金釵石斛原球莖增殖統計方法

用“稱重法”對試驗材料進行稱量(單位:g)，在稱量的同時觀察記錄石斛原球莖的生長狀態。增殖系數能較好地反應原球莖的增殖狀況，增殖系數=(培養后重量—接種量)/接種量。

1．3培養條件優化

石斛懸浮培養過程中可以控制反應條件，如基本培養基、激素種類［7，8］和濃度、培養條件等來達到最優懸浮培養條件。本實驗通過控制懸浮培養培養天數、搖床轉速、搖床的溫度、初始pH等條件，以增重量和石斛堿含量為衡量指標篩選最優液體懸浮培養條件。

1．4生物堿的測定

石斛堿標準曲線的制作:以石斛堿濃度為橫坐標，620nm處吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。樣品總生物堿含量測定:精密稱取上述各石斛樣品粉末0.5g，加濃氨水適量，加氯仿10mL，60℃回流提取2h，冷卻后補充氯仿至原重，抽濾得到生物堿提取液［9］。按標準曲線的制作方法測定吸光度，計算總生物堿的含量。

2結果與討論

2．1不同發酵溫度、發酵時間對金釵石斛懸浮培養的影響

用“稱重法”對試驗材料進行稱量(單位:g)，在稱量的同時觀察記錄石斛原球莖的生長狀態。增殖系數能較好地反應原球莖的增殖狀況，增殖系數=(培養后重量—接種量)/接種量。選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎培養基，控制懸浮培養溫度，分別設定為22℃、25℃、28℃、31℃4個溫度梯度，分別于懸浮培養第10d、20d、30d、35d、40d，取樣稱重，計算增殖系數，并對相應生物堿含量進行測定。結果見表1。從表1可知:溫度不同對石斛懸浮培養的影響比較顯著，31℃時，石斛的增殖系數最小，在培養超過20d后，增殖系數積累量逐漸下降，而生物堿積累量幾乎不變;當溫度為25℃時，隨著發酵天數的延長，石斛增殖系數增大，到培養30d的時候，增殖系數達到最大，為1．114，但是此溫度下生物堿的積累卻在發酵35d時達到最大，為81.78mg/L，與此溫度下培養30天相比差距不大，從成本考慮，選擇培養天數為30d為最優，也基本可以看出，石斛原球莖增殖越多，生物堿也相對越多，基本呈正相關，在后面的培養中主要以石斛原球莖增殖量為衡量指標。

2．2初始pH對石斛懸浮培養石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎培養基，選擇懸浮培養溫度為25℃，培養初始pH分別為5、6、7、8，培養天數為20d，按2.1方法稱重，計算增殖量。從表2可以看出，在同為在溫度為25℃，培養天數30d的情況下，初始pH對石斛懸浮培養影響很大，過酸或過堿都不利于石斛細胞的生長，在pH為6的情況下，石斛生物量積累最快。

2．3搖床轉速對石斛懸浮培養石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎培養基，選擇懸浮培養溫度為25℃，培養初始pH分別為6，培養天數為20d，設定搖床轉速為100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min。按2.1方法稱重，計算增殖量。從表3可以看出，當轉速為120r/min時，石斛生長最好，這與別人做其他植物懸浮培養選定的轉速一樣，說明植物培養轉速不宜過快，過快導致耗氧量增加，營養物質損耗快。

3結論

石斛作為珍貴藥材，藥用歷史悠久，藥用成分豐富，能治療多種疾病，石斛人工栽培技術近年來被廣泛用于生產石斛活性物質。但人工栽培石斛因生產周期過長、病害嚴重等原因而受到限制，因此，近些年來，植物細胞懸浮培養不斷被用于藥用植物生產，已成為目前最有潛力進行藥用植物快速繁殖的途徑。其主要是通過外植種子(莖)體誘導原球莖，再進行懸浮培養從而建立快速繁殖體系。由于本研究原有的研究基礎上已經確定了金釵石斛懸浮培養的基本培養基、植物生長調節劑、碳源、天然添加物等因素，故本實驗主要對金釵石斛懸浮培養條件進行優化，結果表明搖瓶最佳懸浮培養條件是:培養溫度為25℃、培養天數為30d、初始pH為6、搖床轉速為120r/min。

參考文獻:

［1］乙引，陳玲，張習敏，等．金釵石斛研究［M］．北京:電子工業出版社，2009:2-5．

［2］屠國昌．鐵皮石斛的化學成分、藥理作用和臨床應用［J］．海峽藥學，2010，22(2):70-71．

［3］徐瓊，陳素紅，呂圭源．3種不同石斛的化學成分及相關藥理學研究進展［J］．亞太傳統醫藥，2010，6(4):115-118．

［4］昊妹，徐建華，陳立鉆，等．鐵皮石斛降血糖作用及其機制的研究［J］．中國中藥雜志，2004，29(2):160-163．

［5］楊虹，王順春，王崢濤，等．鐵皮石斛莖、葉多糖含量及多糖部位柱前衍生化－高效液相色譜指紋圖譜比較研究［J］．中國中藥雜志，2014，39(5):795-802．

［6］王爽，弓建紅，張寒娟，等．石斛多糖抗氧化活性研究［J］．中國實用醫藥，2009，4(30):15-16．

［7］章金輝，操君喜，朱根發，等．春石斛雜交種多糖及生物堿含量比較研究［J］．熱帶作物學報，2013，34(4):727-731．

［8］金蓉鸞，孫繼軍，張遠名．快速測定鐵皮石斛總生物堿含量方法的優化［J］．西南農業學報，2015，28(2):575-579．

［9］王國梅，韋鵬霄，岑秀芬．不同培養條件對金釵石斛原球莖增殖的影響［J］．廣西園藝，2005，16(6):2-4．

作者:牛曉娟 林夢瑩 楊德彩 張宇斌 單位:貴州師范大學生命科學學院