電針療法對大鼠胃腸激素的影響范文
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《北京中醫(yī)藥大學學報》2015年第十二期
摘要:
目的觀察電針對糖尿病胃輕癱(DGP)模型大鼠胃腸激素的影響，探討電針治療DGP可能的作用機制。方法將60只SD大鼠隨機分為5組:空白對照組，DGP模型組，電針穴位組，電針非穴組，胃復安對照組，每組12只。采用腹腔一次性注射2%鏈脲佐菌素(STZ)配合高糖高脂飼料不規(guī)則飲食制備DGP大鼠模型，連續(xù)8周;用OneTouch血糖儀測血糖，尿糖試紙測尿糖，實驗結(jié)束后觀測大鼠胃排空率、腸移行率，ELISA法檢測大鼠血清生長激素(GH)水平和胃竇組織促生長素(Ghrelin)含量。結(jié)果與空白對照組比較，DGP模型組大鼠血糖及尿糖值均明顯升高(P＜0．01)，胃排空率、腸移行率、血清GH水平及胃竇Ghrelin含量均明顯下降(P＜0．01或P＜0．05);與DGP模型組比較，電針穴位組大鼠血糖及尿糖值均明顯降低(P＜0．05)，胃排空率、腸移行率、血清GH水平及胃竇Ghrelin含量均明顯升高(P＜0．01或P＜0．05)。結(jié)論電針能調(diào)節(jié)血糖水平，促進胃腸排空，改善DGP癥狀，其作用機制可能與電針上調(diào)血清GH水平和胃竇組織Ghrelin含量有關(guān)。
關(guān)鍵詞:
糖尿病胃輕癱(DiabeticGastroparesis，DGP)是以胃排空延遲，胃動力低下為主要特點的臨床癥候群，主要表現(xiàn)為厭食、噯氣、早飽、食欲不振、惡心干嘔、體重減輕等癥狀，是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一。其病因復雜多變，大多數(shù)研究認為其發(fā)病機制可能與高血糖、自主神經(jīng)病變、胃腸激素失衡及胃腸道平滑肌超微結(jié)構(gòu)的改變等因素有關(guān)［1］。胃腸激素的參與則被認為在此類疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，目前臨床治療DGP常用促胃動力藥來緩解癥狀，但療效不佳，且長期使用易產(chǎn)生耐藥性。而采用針灸治療DGP有一定的療效和優(yōu)勢，能治愈或改善胃輕癱的癥狀，同時又能兼顧降血糖，起到雙重的治療作用［2－5］。但有關(guān)針灸治療DGP的文獻報道大多數(shù)只停留在臨床研究，基礎(chǔ)研究太少，且缺乏作用機制的研究。本實驗通過建立DGP大鼠模型，采用ELISA法檢測血清生長激素(GH)水平和胃竇組織促生長素(Ghrelin)含量，以探討電針防治DGP的作用機制。
1材料
1．1動物健康成年SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體重(231±10)g，共60只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號:43004700002152。飼養(yǎng)溫度25℃，相對濕度50%～70%，自由攝食、飲水。
1．2主要試劑鏈脲佐菌素(STZ):美國Sigama公司生產(chǎn)，臨用前用0．1mmol/L(pH4．2，4℃)檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液配成2%濃度的溶液;高糖高脂飼料:由普通飼料按比例(普通飼料、熟豬油、蔗糖、奶粉、雞蛋之比為58∶15∶20∶5∶2)加工而成;血糖試紙:美國強生公司生產(chǎn);尿糖試紙:廣州花都高爾寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);胃復安:山西云鵬制藥生產(chǎn);酚紅:天津恒興化學試劑制造有限公司生產(chǎn);檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉:湖南匯虹試劑公司生產(chǎn);三氯乙酸:天津科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn);大鼠GH、Ghrelin酶聯(lián)免疫試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。
1．3主要儀器血糖儀:美國強生公司生產(chǎn);電子天平:日本島津AEL-120型;電針儀:華佗牌SDZ-Ⅱ型;針灸針:蘇州華倫醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn);紫外分光光度計:日本島津UV-1800型;酶標儀:上海熱電MultiskanMK3。
2方法
2．1糖尿病胃輕癱模型制作根據(jù)參考文獻［6］，將大鼠購回先適應性喂養(yǎng)7d，均經(jīng)血糖試紙檢測、尿糖試紙檢測，血糖正常、尿糖陰性者入選。禁食12h，空白對照組大鼠于左下腹腔內(nèi)單次注射等容量的0．1mmol/L(pH4．2，4℃)檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，剩余大鼠按55mg/kg的劑量于左下腹腔內(nèi)單次注射2%STZ溶液，72h后取尾靜脈血用OneTouch血糖儀和血糖試紙測血糖，即刻血糖≥16．7mmol/L者作為糖尿病大鼠。空白對照組大鼠給予普通飼料規(guī)則喂養(yǎng)，剩余大鼠給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)(即采取單日上午和雙日下午進食法)，每周測定血糖及尿糖1次，同時觀察大鼠的體重、飲食、飲水、毛色、大小便、活動及精神狀況等，持續(xù)8周，期間檢測血糖＜16．7mmol/L者予以剔除實驗。DGP造模成功指標:①監(jiān)測大鼠血糖、尿糖，血糖≥16．7mmol/L、尿糖陽性者;②大鼠一般情況及大便性狀與正常對照組有明顯差別者;③大鼠胃排空率及腸移行率與正常對照組相比有顯著差異者。模型制作方法詳見參考文獻［7］。
2．2穴位及非穴對照點定位穴位定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學》常用動物穴位定位法及擬人對照法定位。“足三里”:膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5mm處;“三陰交”:后肢內(nèi)踝尖直上10mm處;“梁門”:以胸骨柄上緣和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點為肚臍，胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點的水平線與鎖骨中線相交處;“足三里”對照點:在平“足三里”穴外側(cè)5mm處;“三陰交”對照點:在平“三陰交”穴后側(cè)5mm處;“梁門”對照點:在平“梁門”穴外側(cè)5mm處。
2．3電針方法將大鼠束縛于鼠板上，取大鼠單側(cè)“足三里”“三陰交”“梁門”穴或這些穴位的對照點(非穴點)，定位后局部剪毛，穴位針刺由專人操作，均采用0．25mm×25mm毫針直刺5～7mm，針刺后，用電針儀的一組輸出線的負極接在穴位或非穴位對照點上，正極接在該穴位或非穴對照點下2mm的附點上，每只大鼠共接3組輸出線，用疏密波(疏波為10Hz，密波為50Hz;疏波時間為10s，密波時間為15s)，強度以毫針或穴位周圍肌肉出現(xiàn)輕微顫抖為度，留針20min，隔日左右交替治療，每日1次，連續(xù)治療15d。
2．4分組治療將60只SD大鼠完全隨機分成5組:空白對照組，DGP模型組，電針穴位組(模型+電針穴位組)，電針非穴位組(模型+電針穴位對照點組)，胃復安對照組(模型+胃復安灌胃組)，每組12只。空白對照組、DGP模型組大鼠每日僅捆綁不針刺20min，電針穴位組每日捆綁后電針穴位20min，電針非穴組每日捆綁后電針穴位對照點20min，胃復安對照組每日予以1．7%胃復安藥液(0．17mg/kg)灌胃治療，每日1次，連續(xù)處理15d，實驗期間大鼠均自由攝食和飲水。實驗結(jié)束后，大鼠禁食24h，禁水2h，于第16天給予5g/L酚紅溶液2mL灌胃，20min后以10%水合氯醛按3mL/kg劑量腹腔注射麻醉后取材。
2．5標本采集血清處理:大鼠麻醉固定后，予腹主動脈采血，常溫放置2～3h，4℃3000r/min離心15min，取上清液，EP管分裝，－20℃保存，待測GH水平。胃腸處理:大鼠剖腹，結(jié)扎賁門及幽門取胃，沿胃大彎切開，用冰0．9%氯化鈉溶液沖洗并收集胃內(nèi)容物，定容20mL，測胃排空;迅速剪取胃竇組織一塊置凍存管中，液氮中保存，待測Ghrelin含量;取小腸，測腸移行率。
2．6指標檢測(1)一般情況:仔細觀察大鼠的血糖、尿糖、體重、飲食、飲水、毛色、大小便、活動及精神狀況。(2)胃排空:將收集的20mL胃內(nèi)容物加入0．5mol/LNaOH20mL攪拌混勻，靜置1h后取5mL上清液，加入20%三氯乙酸0．5mL去蛋白，以3500r/min離心10min，取上清液在560nm波長紫外分光光度計下檢測吸光度值(OD)。胃排空率計算:胃排空率=［1－實測酚紅吸光度(OD)/標準酚紅吸光度(OD)］×100%。(3)腸移行率:將小腸輕輕剝離后直鋪在冰面上，不牽扯，先肉眼觀察小腸被酚紅染成紅色的末端，然后用眼科剪在該末端剪一小口，往該口上滴少量0．5mol/L的NaOH溶液，若變紫色則為酚紅到達的部位，之后在紫色區(qū)前后各滴少量NaOH溶液以確定酚紅到達的實際部位，然后用直尺測量幽門至回盲瓣全長(A)及幽門至酚紅染成紅色末端的距離(a)。以幽門至酚紅染成紅色末端的距離占幽門至回盲瓣全長的百分率為腸移行率。腸移行率(%)=a/A×100%。(4)胃腸激素測定:按照南京建成生物工程研究所試劑盒的要求，采用ELISA法檢測血清GH水平及胃竇組織Ghrelin含量。
2．7統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行處理。資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x珋±s)表示，多組計量資料采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett’sT3法;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)(M)、四分位間距(Q)表示，采用秩和檢驗。以α=0．05作為檢驗水準。
3結(jié)果
3．1一般情況實驗期間，空白對照組大鼠表現(xiàn)機警活潑、反應靈敏、毛色光滑，進食及二便均正常;模型組和治療組大鼠在造模3d后均出現(xiàn)多飲、多食、多尿，糞便稀溏，味重，4周后，大鼠出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡、反應遲緩，逐漸出現(xiàn)尿少，大便干稀不定，味臭難聞，體重與空白對照組比較明顯減輕，尤其以模型組最為明顯。
3．2治療后各組大鼠血糖、尿糖值比較與空白對照組比較，DGP模型組大鼠血糖及尿糖值均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，說明造模后，各組大鼠血糖及尿糖值均持續(xù)升高;與DGP模型組比較，電針穴位組大鼠血糖及尿糖值均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);與胃復安對照組比較，電針穴位組大鼠血糖及尿糖值均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。說明電針穴位可降低血糖及尿糖值，調(diào)節(jié)大鼠的血糖水平，改善DGP癥狀。結(jié)果見表1。
3．3各組大鼠胃排空率和腸移行率比較與空白對照組比較，DGP模型組大鼠胃排空率和腸移行率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明造模組大鼠胃排空時間延長，小腸移行緩慢;與DGP模型組比較，電針穴位組大鼠胃排空率和腸移行率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。與電針非穴組比較，電針穴位組胃排空率和腸移行率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明電針治療后，電針穴位組能明顯改善胃排空狀況，增加胃腸運動功能。結(jié)果見表2。
3．4各組大鼠血清GH水平、胃竇組織Ghrelin含量的比較與空白對照組比較，DGP模型組大鼠GH水平和Ghrelin含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05或P＜0．01);與DGP模型組比較，電針穴位組大鼠GH水平和Ghrelin含量明顯升高(P＜0．05或P＜0．01)。結(jié)果見表3。
4討論
糖尿病胃輕癱是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，多見于血糖控制不佳的糖尿病患者，嚴重影響患者的工作和生活質(zhì)量［8］。其主要特點是胃排空延遲，胃節(jié)律紊亂，胃動力低下，從而導致胃麻痹，近年來的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，胃腸激素在胃運動的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。Ghrelin是1999年Kojima等發(fā)現(xiàn)的第一個生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，由28個氨基酸組成的小分子多肽。Ghrelin除在攝食和能量代謝、心血管功能等方面具有調(diào)節(jié)作用外，還具有調(diào)節(jié)胃腸動力作用。邱氏等［9］證實了Ghrelin能提高糖尿病小鼠的胃排空能力，其作用機制可能是通過肌間神經(jīng)叢神經(jīng)系統(tǒng)的硝基能神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)上的受體而起作用。GH由胃底部黏膜泌酸腺X/A細胞合成并入血，其在調(diào)節(jié)糖尿病患者血糖濃度及胃動力障礙方面起了重要作用。劉氏等［10］研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血糖控制不佳可能與皮質(zhì)醇(PTC)、GH有關(guān)。薛氏［11］研究顯示糖尿病患者的GH水平較健康人高，胃動力障礙的糖尿病患者GH水平尤其高，通過降低糖尿病患者血清GH可減輕其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［12］。而本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠GH水平和Ghrelin含量均下降，胃排空率和腸移行率明顯減慢，血糖及尿糖值升高，與正常對照組比較P＜0．05或P＜0．01，與文獻報道不相一致。有研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin具有促進垂體前葉分泌GH［13］，模型組大鼠血清GH水平降低可能是由于Ghrelin含量降低抑制垂體前葉分泌GH。經(jīng)過治療后，電針穴位組大鼠血清GH水平、胃竇Ghrelin含量、胃排空率及腸移行率均明顯升高，血糖及尿糖值均明顯下降，可能是由于Ghrelin含量升高作用于垂體前葉分泌GH。本實驗結(jié)果表明，電針能調(diào)節(jié)大鼠血糖水平，促進胃腸排空，改善胃腸運動功能障礙，其作用機制可能是電針治療能上調(diào)血清GH水平和胃竇組織Gh-relin含量，但具體通過何種通路產(chǎn)生作用，則有待進一步研究。
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作者：林亞平 賀鳳娥 彭艷 萬全荃 沈菁 單位：湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 針灸生物信息分析重點實驗室 湖南中醫(yī)藥大學研究生院