大鼠肝臟與蛋白的變化范文

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《航天醫學與醫學工程雜志》2014年第三期

1方法

1．1實驗動物二級雄性SD大鼠100只，體重180～260g(航空醫學研究所提供)，適應性飼養7d后隨機分為4組，每組25只。其中3組為+Gz暴露組，1組為正常對照組。

1．2試劑與儀器逆轉錄酶M-MLV(Promega公司);OligoDT，dNTP(10mmol/L)(Takara公司);TRIzol(Invitro-gen公司);大鼠誘導型HSP70cDNA序列(EF100780)、PCR反應體系、HSP70兔抗鼠多克隆抗體、GAPDH鼠抗單克隆抗體(南京金斯瑞);ECL化學發光試劑、HRP標記的山羊抗兔IgG(上海江萊);X光片自動洗片機(柯達X-OMATBT膠片(FF057/FF081));心臟灌注設備;恒溫冰凍切片機;Quantimet圖像分析系統(德國Leica);動物離心機等。

1．3+Gz暴露3組實驗動物分別用離心機進行+Gz暴露。暴露時將大鼠置于一內徑為17cm×8cm×5cm的樹脂盒中，頭部朝向旋轉軸心，尾部向外水平并被固定于離心機的平臺上，分別暴露于+2Gz，+6Gz，+10Gz，峰值作用時間3min，加速度增長率1G/s。對照組同樣條件置于樹脂盒中，但不進行+Gz暴露。

1．4樣本制備分別于暴露后6h、12h、24h、48h、96h，腹腔注射苯巴比妥鈉50mg/kg麻醉大鼠，生理鹽水心臟灌注后用4%多聚甲醛灌注2h，迅速取肝臟組織，液氮冷凍，－80℃保存。標本取齊后，包埋肝臟組織，于恒冷切片機中冰凍切片。

1．5RNA提取及RT-PCR檢測取凍存裂解的細胞，Trizol法提取細胞RNA，測定RNA濃度和純度。獲得的RNA溶液保存于－80℃待用。利用逆轉錄酶MMLV進行反轉錄得到cDNA。利用Premier5．0軟件設計引物。HSP70引物上游5’-GGTGCTGACGAAGATAAAGGAC-3’，下游5’-TCGATG-GCCTCGAACAGAG-3’。β-actin引物:上游5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游5’-GAGGGACTTCCTGTAACCAC-3’。配制PCR反應體系(25μL):cDNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×TaqMastermix12．5μL，加ddH2O補齊至25μL。92℃預變性5min，然后92℃30s，54℃30s，72℃30s共32個循環;最后72℃延伸10min。反應結束后取10μL產物，經2%瓊脂糖凝膠(含0．5g/mL溴化乙錠)電泳，紫外燈下觀察、拍照，計算HSP70與β-actin條帶灰度比值。

1．6Westernblot分析收集蛋白樣品，電泳，轉膜(PVDF膜，Milli-pore公司，美國)，TBST洗膜，然后再以含5%脫脂奶粉的TBST38℃封閉1h。分別加入HSP70兔抗鼠多克隆抗體(1∶800稀釋)和GAPDH鼠抗單克隆抗體(1∶4000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后，GAPDH直接通過ECL化學發光試劑顯影;HSP70再加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶10000稀釋)，38℃孵育60min，TBST洗滌，ECL化學發光試劑顯影。HSP70蛋白相對含量用HSP70/GAPDH灰度比值表示。

1．7統計分析應用SPSS13．0統計軟件，利用HSP70/GAPDH灰度比值及HSP70與內對照β-actin條帶灰度比值采用重復設計的方差分析進行組內及組間兩兩比較。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1+Gz暴露大鼠肝臟HSP70mRNA表達+Gz暴露12h各組電泳分析結果見圖1，HSP70擴增片段為550bp，β-actin擴增片段為623bp。實驗組和對照組HSP70陽性表達率為100%。+Gz暴露后大鼠肝臟HSP70mRNA表達趨勢(HSP70/β-actin值)如圖2所示。可以看出，暴露后6h，各+Gz暴露組大鼠肝臟組織HSP70mRNA表達水平較對照組相比顯著升高(P＜0．05)。暴露后6h、12h、24h、48h4個時間點，各+Gz暴露組大鼠肝臟HSP70mRNA表達水平均高于對照組(P＜0．05);+6Gz組大鼠肝臟HSP70mRNA表達水平均高于+2Gz和+10Gz組(P＜0．05)。+6Gz暴露后12h大鼠肝臟HSP70mRNA表達水平最高(P＜0．05)，+2Gz組HSP70mRNA表達水平在各個時間點明顯高于+10Gz組(P＜0．05)，暴露后48h，+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達水平無明顯差別，但此時+2Gz組與+6Gz組HSP70mRNA表達水平高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后96h，各+Gz組大鼠HSP70mRNA表達水平與對照組相比差異無統計學意義(P＞0．05)。

2．2+Gz暴露對HSP70蛋白表達的影響以GAPDH為內參照，HSP70蛋白表達量的Westernblot結果見圖3，各組不同時間+Gz暴露后HSP70表達趨勢(HSP70/GAPDH)如圖4所示。可以看出，+Gz暴露后6h、12h、24h、48h4個時間點，3個+Gz暴露組HSP70蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05)。+Gz暴露后6h、12h、24h、48h，+6Gz組HSP70表達水平高于+2Gz組、+10Gz組(P0．05)，+2G組表達高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后6h，+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達高于+10Gz組(P＜0．05)。暴露后12h，+2Gz組、+6Gz組HSP70蛋白表達高于+10Gz組(P＜0．05)。其中+6Gz暴露后12hHSP70蛋白表達最高，差異有顯著性意義(P＜0．05)。+Gz暴露后96h，各+Gz組大鼠肝臟HSP70表達水平與對照組相比，差異無顯著性(P＞0．05)。

3討論

研究表明，在受到加速度、缺血、缺氧、熱暴露等因素作用后的生物體通過激活HSF、HSE并與之相結合等步驟，誘導調節轉錄產生HSP70mR-NA，HSP70mRNA再經轉錄后經過調節、翻譯等步驟表達產生HSP70［8］。本研究結果提示+Gz暴露可刺激肝臟HSP70mRNA及蛋白的表達。本研究中，+Gz暴露誘導產生HSP70mRNA的機制，一方面可能是+Gz暴露導致肝組織相對缺血、缺氧，誘導肝臟組織產生HSP70mRNA。進一步經過轉錄翻譯后生成HSP70，這與既往肝缺血模型誘導HSP70mRNA及HSP70表達的機制是相同的［9-10］。除此之外，+Gz暴露時造成的機體相關臟器的高壓力及其在加速度作用下所受到的機械擠壓等力學因素，可能在HSP70mRNA的誘導產生中也起著一定的作用，具體機制有待進一步研究。目前，絕大多數學者認為HSP70對缺血、缺氧所致的肝損傷有保護作用。主要有分子伴侶作用、抗炎作用、免疫調節作用、抑制細胞凋亡及抗氧化作用［10-14］。從實驗結果來看，+6Gz暴露組誘導產生的HSP70mRNA及HSP70表達水平最高，+2Gz組次之，+10Gz組相對較低。說明在一定G值范圍內，隨+Gz暴露強度的增加，HSP70mRNA及HSP70的表達水平也相應增高，中等強度G值(+6Gz)作用下，誘導產生的HSP70mRNA及HSP70量最多。但當G值超過一定限度時，隨G值水平的增加，HSP70mRNA及蛋白的表達水平反而相對下降。輕度和中度的缺血、缺氧刺激作用時誘導產生的HSP70mRNA及其產物的表達水平較高，表達分布范圍也較廣，而在重度缺血條件下，肝組織的HSP70mRNA及HSP70的表達反而會受到相對抑制，誘導產生的mRNA及HSP70蛋白的水平相對較低，分布范圍也較局限，可能與重度缺血造成臟器組織細胞的嚴重損傷，使得細胞的轉錄過程受到抑制有關［3-4］。實驗顯示，HSP70基因及其產物在正常大鼠肝臟內含量較低，當應激因素(加速度)作用于生物體時，HSP70基因被激活而迅速表達。正加速度暴露后12h，+2Gz組、+6Gz組、+10Gz組所產生的HSP70mRNA及HSP70變化趨勢具有一致性，表明其基因無內含子結構，形成的mRNA無需切割修飾，蛋白的組裝能夠在短時間內完成，HSP70誘導型蛋白可以迅速表達［1］。

4結論

+Gz暴露可以誘導大鼠肝臟組織HSP70mRNA及HSP70蛋白的表達，使大鼠肝臟組織中HSP70mRNA及HSP70蛋白表達水平顯著增強。+Gz暴露環境下機體可能通過代償機制增加HSP70表達實現對肝臟的保護，其具體機制我們將在今后的實驗中作進一步的研究。

作者：朱懷成張洪義劉承利張宏義趙剛孔亞林單位：安徽醫科大學空軍總醫院肝膽外科