小腦早期發(fā)育思考范文

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《南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2015年第七期

1材料和方法

1．1材料B6小鼠（南京大學(xué)動物模式所），129-Ptch1tm1Mps／J（簡稱Ptch1＋／-，美國JacksonLab引進），多聚甲醛粉末（P6148，Sigma公司，美國），石蠟（A6330，Sigma公司，美國），檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（福州邁新公司）、封閉用正常山羊血清（北京中杉金橋公司），抗體稀釋液（CellSignalingTechnology公司，美國），濃縮型DAB試劑盒、兔超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒、小鼠超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋公司），F(xiàn)luoromount抗淬滅劑、封片劑（Sigma公司，美國），一抗：兔抗Pax6（Co-vance公司，美國），小鼠抗NeuN（Millipore公司，美國）。二抗：驢抗小鼠AlexaFluor594、驢抗兔Alex-aFluor488（Invitrogen公司，美國）。45％左右旋葡萄糖溶液、SPITE、OleicAcidAlbumin／LinoleicAcid和N-AcetylCysteine粉末（Sigma公司，美國），Neuralbasalmedium、Pen／Strep、Glutamine、B27（Gibco，Invitrogen公司，美國），Percollstocksolution（GEhealth-care公司，美國）。DNase、Trypsin粉末（Amresco公司，美國）。實驗室自制含Shh配基的條件培養(yǎng)基（ShhN-CM）、對照培養(yǎng)基（293T-CM）。Click-iT祿REdUAlexaFluor祿R555ImagingKit（LifeTechnologies公司，美國）、MEM、Eagle培養(yǎng)基、馬血清、glutamaxⅠ、10％葡萄糖（Gibco，Invitrogen公司，美國），器官培養(yǎng)微孔濾膜（Millipore公司，美國）。

1．2方法

1．2．1小鼠腦組織免疫熒光檢測將實驗所需的出生2、7、14d（P2、P7、P14）的B6小鼠用75％的酒精噴濕消毒，用剪刀將小鼠斷頭后剪開小鼠頭部皮膚，沿矢狀縫剪開顱骨，剝離腦組織，放入50mL4％多聚甲醛4℃過夜，第2天分離小腦，沿矢狀縫將小腦分成2部分，固定12h。將固定后的腦組織取出，脫水，透蠟，包埋，切片。將切好的小鼠石蠟切片放入二甲苯中脫蠟3次，100％～50％酒精梯度脫水、檸檬酸鹽高溫抗原修復(fù)、5％正常山羊血清（TBS稀釋）封閉1h，分別滴加一抗Pax6和NeuN4℃孵育過夜、TBS洗3次，每次2min，PBS按1∶200的比例稀釋相對應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1～2h，TBS洗3次，每次2min，用含DAPI的防熒光淬滅的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡拍照。

1．2．2P7小鼠小腦GCP細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)及EdU檢測取出生后7d的小鼠小腦GCP細(xì)胞分離、純化、種板培養(yǎng)24h后，向細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入ShhN-CM和293T-CM，刺激細(xì)胞，每2d換1次液，之后做EdU檢測（檢測步驟同下文所述），倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1．2．3小鼠腦片體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及應(yīng)用取出生7d的小鼠腦組織，在體式鏡下將小腦分離至含有1×glutamax的冰MEM中；用組織切片機將小腦沿矢狀面切成厚度為350μm的腦片；將腦片分成單個，轉(zhuǎn)移到放置在含有1mL培養(yǎng)基的6孔板微孔濾膜上，5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成功建立腦片體外培養(yǎng)系統(tǒng)后，我們分別對體外培養(yǎng)的腦片做相應(yīng)處理后做EdU檢測：配置2×EdU工作液，加入培養(yǎng)皿，使其終濃度變成1×，37℃孵育30min，4％多聚甲醛4℃固定過夜，3％BSA／PBS洗2次，1mL0．5％TritonX-100／PBS透化，室溫孵化40min，3％BSA／PBS洗2次，每孔加入250μL的1×Click-iT反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，700μL3％BSA／PBS洗2次，去離子水洗腦片1次。將腦片平放至載玻片上，含有DAPI的封片劑封片，4℃避光保存，倒置熒光顯微鏡觀察。

1．2．4小鼠腦組織HE染色將腦組織石蠟切片依次放入：二甲苯中3次，每次10min；二甲苯∶無水乙醇（1∶1）1min，100％、95％、85％、75％和50％乙醇各1min，ddH2O中1min，蘇木素染液1～2min；自來水洗2次，每次各1min；ddH2O中1min，伊紅染液1～2min，95％乙醇1min，100％乙醇1min；二甲苯2次，每次1min，中性樹脂封片，通風(fēng)后倒置熒光顯微鏡觀察。

1．3統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18．0進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用重復(fù)資料測定方差分析和t檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1小鼠出生后7d是小腦外顆粒層GCP細(xì)胞增殖的高峰取P2、P7、P14小鼠小腦，免疫熒光檢測顆粒細(xì)胞及GCP細(xì)胞的蛋白標(biāo)記物Pax6和分化成熟的顆粒神經(jīng)元蛋白標(biāo)記物NeuN的表達情況。我們觀察到，P2小鼠小腦Pax6表達陽性的外顆粒層只有薄薄的一層，整個小腦幾乎沒有NeuN的表達；P7小鼠小腦中Pax6在EGL的表達變成厚厚的一層，并且出現(xiàn)了NeuN陽性的內(nèi)顆粒層，P14小鼠小腦外顆粒層的GCP細(xì)胞大部分都停止增殖，向內(nèi)遷移停留在內(nèi)顆粒層，而外顆粒層則變得越來越薄，內(nèi)顆粒層越來越厚（圖1）。上述結(jié)果與其他文獻報道一致，即小鼠在出生后小腦外顆粒層的GCP細(xì)胞會不斷增殖，在出生后7d達到增殖高峰；隨著小腦的不斷發(fā)育，一些GCP細(xì)胞退出細(xì)胞周期，向小腦的內(nèi)部遷移，慢慢成為分化成熟的顆粒神經(jīng)元細(xì)胞，形成內(nèi)顆粒層。

2．2Shh信號是促進小腦外顆粒層細(xì)胞增殖的重要信號為了探究Shh信號通路在小腦外顆粒層細(xì)胞增殖中所起的作用，我們?nèi)7小鼠小腦的顆粒前體細(xì)胞的原代細(xì)胞，并且分別用含有Shh配基的條件性培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞120h，EdU染色觀察細(xì)胞的增殖變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不加Shh配基培養(yǎng)的細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)極少，而加了Shh配基培養(yǎng)的細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（圖2），結(jié)果表明Shh信號在刺激小腦外顆粒層細(xì)胞的增殖中起了至關(guān)重要的作用。

2．3小鼠小腦腦片體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及應(yīng)用為了更直觀地觀察小腦的動態(tài)發(fā)育過程，我們分離P7小鼠小腦進行體外培養(yǎng)。EdU染色結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)48h，增殖的細(xì)胞開始出現(xiàn)在外顆粒層和分子層，繼續(xù)培養(yǎng)48h，EdU陽性細(xì)胞在小腦整個外顆粒層、分子層和內(nèi)顆粒層都有分布（圖3A）。統(tǒng)計48、96h的EdU陽性細(xì)胞數(shù)在外顆粒層－分子層（EGL＋ML）和內(nèi)顆粒層（IGL）所占的百分比發(fā)現(xiàn)：體外培養(yǎng)48h，EdU陽性細(xì)胞有70．64％分布在外顆粒層和分子層，僅29．46％分布在內(nèi)顆粒層；而在體外繼續(xù)體外培養(yǎng)48h后，外顆粒層和分子層EdU陽性細(xì)胞降到42．65％，內(nèi)顆粒層EdU陽性細(xì)胞增加到57．34％（圖3B）。說明內(nèi)顆粒層的細(xì)胞是由外顆粒層或分子層遷移而來。因此，通過體外培養(yǎng)小腦腦片，我們可以清楚地看到顆粒細(xì)胞由外顆粒層向內(nèi)顆粒層遷移的軌跡。為了進一步了解Shh信號在小腦外顆粒層細(xì)胞的增殖及遷移中所起的作用，在體外培養(yǎng)的小腦腦片中，利用CPA———Shh信號通路的小分子抑制劑處理腦組織切片24h后，發(fā)現(xiàn)處理組腦片中EdU陽性細(xì)胞明顯低于對照組（DMSO處理），且與對照組相比發(fā)現(xiàn)外顆粒層和分子層E-dU陽性細(xì)胞數(shù)雖然減少，但是在不同條件下內(nèi)顆粒層的EdU陽性細(xì)胞數(shù)相對減少并不明顯（圖3A）；統(tǒng)計分析小腦各層的EdU陽性細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，雖然CPA明顯降低EGL的EdU陽性細(xì)胞，但是對IGL層幾乎沒有影響（圖3B、C）。這一結(jié)果表明，在小腦發(fā)育進程，Shh信號的主要作用是促進小腦外顆粒層GCP細(xì)胞增殖，但不影響其遷移。

2．4Shh信號通路異常激活后小鼠小腦外顆粒層出現(xiàn)異常增殖的細(xì)胞。為了探究Shh信號異常激活對小鼠小腦外顆粒層細(xì)胞增殖的影響，我們分別取出生后17d的野生型（WT）和Ptch基因敲除（Ptch＋／-）的基因型小鼠的小腦，做了HE染色和免疫熒光檢測GCP細(xì)胞增殖的蛋白標(biāo)記物Ki67及成熟分化的顆粒神經(jīng)元的蛋白標(biāo)記物NeuN的表達情況。HE染色結(jié)果觀察到，與野生型的小鼠小腦（圖4A、B）相比，Ptch＋／-基因型小鼠的小腦外顆粒層出現(xiàn)了一層異常的細(xì)胞（圖4E、F）。免疫熒光檢測Ki67和NeuN觀察到，野生型小鼠小腦的外顆粒層幾乎沒有Ki67的表達，內(nèi)顆粒層NeuN大量表達（圖4C、D），Ptch＋／-基因型小鼠小腦外顆粒層Ki67出現(xiàn)陽性表達，內(nèi)顆粒層Ne-uN大量表達（圖4G、H）。結(jié)果表明SHH信號通路異常激活后，小鼠小腦外顆粒層的細(xì)胞會出現(xiàn)異常增殖，并且這些異常增殖的細(xì)胞不能夠順利向內(nèi)顆粒層遷移。

3討論

本文研究了Shh信號通路在小腦發(fā)育早期通過影響小腦EGL層的GCP細(xì)胞的增殖及遷移而影響小腦的發(fā)育。大量研究表明在小腦發(fā)育過程中，若Shh信號通路中的Ptch基因發(fā)生突變，導(dǎo)致信號通路過度激活，會引起EGL層過度擴增，這可能與MB的發(fā)生密切相關(guān)。但這一過程發(fā)生的分子機制尚不清楚。我們通過建立一個新的模擬體內(nèi)實驗的系統(tǒng)，更加直觀清楚地觀察小腦發(fā)育早期EGL層GCP細(xì)胞的增殖、遷移及Shh信號通路在小腦外顆粒層GCP細(xì)胞的增殖及遷移過程中所起的作用。并利用實驗室引進Ptch＋／－小鼠這一實驗動物模型觀察在小腦發(fā)育早期Shh信號通路異常激活對小腦EGL層GCP細(xì)胞增殖的影響，希望能夠找出MB可能發(fā)生的分子機制。首先，我們通過石蠟切片免疫熒光實驗檢測了P2、P7和P14小鼠小腦中顆粒細(xì)胞、GCP細(xì)胞和成熟分化了的顆粒神經(jīng)元的表達情況，發(fā)現(xiàn)在出生后7d的小鼠小腦中GCP細(xì)胞的增殖最為明顯，隨著時間的推移，到14d時GCP細(xì)胞大部分都停止增殖，并向內(nèi)遷移停留在內(nèi)顆粒層。隨后，我們?nèi)7小鼠小腦的GCP細(xì)胞的原代細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，并分別用加入Shh配基和不加配基刺激細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Shh配基的細(xì)胞不斷增殖，不加Shh配基的細(xì)胞幾乎沒有增殖信號，這表明Shh信號通路是促進小腦外顆粒層細(xì)胞增殖必不可缺的一部分。為了更加接近體內(nèi)及更加直觀真實地觀察小腦的動態(tài)發(fā)育過程，我們成功建立了體外培養(yǎng)小腦腦片系統(tǒng)，通過這一系統(tǒng)的建立我們清楚地觀察到顆粒細(xì)胞由外顆粒層向內(nèi)顆粒層遷移的軌跡，并與前期石蠟切片免疫熒光實驗完全符合。同時，在這一系統(tǒng)成功建立的基礎(chǔ)上利用CPA這一Shh信號通路的小分子抑制劑處理腦組織切片24h后，發(fā)現(xiàn)處理組腦片中EdU陽性細(xì)胞明顯低于對照組（DMSO處理），說明CPA明顯抑制了顆粒細(xì)胞前體的增殖。再統(tǒng)計分析小腦各層的EdU陽性細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，雖然CPA明顯降低了EGL的EdU陽性細(xì)胞，但是對IGL層沒有影響。這一結(jié)果表明，在小腦發(fā)育過程中，Shh信號的主要作用只是促進小腦外顆粒層GCP細(xì)胞的增殖，不影響其遷移。最后利用實驗室引進Ptch＋／－小鼠模型，通過對出生后17dWT和Ptch＋／－小鼠小腦石蠟切片HE染色和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，Shh信號通路過度激活會引起小腦外顆粒層細(xì)胞異常增殖，并且這些異常增殖的細(xì)胞不能夠順利向內(nèi)顆粒層遷移。Shh信號通路對小腦早期發(fā)育的調(diào)控是極其復(fù)雜的，它的異常激活與MB的發(fā)生也密切相關(guān)［18］，但Shh信號通路是通過怎樣的途徑調(diào)節(jié)小腦的發(fā)育，MB發(fā)生的確切分子機制怎樣尚不清楚。本研究從細(xì)胞分子水平上重現(xiàn)了小腦發(fā)育早期相關(guān)細(xì)胞的增殖、遷移情況，為MB發(fā)生的可能分子機制提供了新的理論依據(jù)，同時，成功建立體外小腦腦片培養(yǎng)系統(tǒng)，也為我們后期觀察其他信號通路對小腦發(fā)育的調(diào)控提供了非常有利的實驗工具。

作者：劉曉同 李三恩 樂糰 程雁 單位：南京醫(yī)科大學(xué)發(fā)育遺傳學(xué)系