醫用生物膠原蛋白對缺損組織修復治療范文

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摘要:膠原蛋白因具有低免疫原性，良好的生物相容性和生物降解性，在醫用生物材料方面得到廣泛應用。目的:綜述近年來國內外膠原蛋白的來源、生物活性、改性及其在醫用生物材料方面的應用進展。方法:通過計算機檢索2010至2018年PubMed、EIsevier、Springerlink、中國知網等數據庫發表的相關文章，英文檢索詞為“callagen,crosslinking,immunogenicity,biocompatibility,tssueengineering”，中他文檢索詞為“膠原蛋白，交聯，免疫原性，生物相容性，組織工程”●會結果與結論:膠原蛋白主要從動物肌腱、皮膚、尾巴等組織中提取獲得的，具有良好生物相容性、低免疫原有性和降解性等特性，但缺乏足夠的機械強度。交聯改性或與其他生物材料復合使用均可改善膠原蛋白的機械性能。目前，膠原蛋白己被廣泛應用于止血劑與創面敷料、生物補片、骨修復材料、藥物釋放載體及作為組織工程支架等方面:臨床使用顯示，膠原蛋白對缺損組織的修復、再生及重建有著顯著促進作用。

關鍵詞:膠原蛋白:免疫原性:生物相容性:生物降解性:交聯:組織工程生物材料

引言Introduction

膠原蛋白是結締組織的主要成分，約占動物體內蛋白質含量的1/3，具有支撐機體器官，維持機械穩定性、彈性和強度等功能。作為一種天然的生物資源，膠原蛋白具有低免疫原性、良好的生物相容性和生物可降解性，被廣泛用作醫用生物材料[1]。目前臨床上使用的膠原蛋白類產品主要有創面敷料、生物補片、骨修復材料、縫合線、組織工程支架等。但鑒于臨床問題的復雜性及產品的升級換代需求，膠原蛋白的應用研究仍有許多亟待解決的難題，比如異種源膠原蛋白潛在的免疫反應[2]、殘留交聯劑可能帶來的細胞毒性[3]、植入類膠原蛋白產品的機械強度與降解可控性等。文章從膠原蛋白來源、生物學特性、改性研究及其在醫用生物材料方面的應用進行了介紹，旨在為膠原蛋白在臨床上的應用研究提供指導與參考，為其進一步深入研究提供討論理論基礎。

1資料和方法Dataandmethods

1.1資料來源

由第一作者檢索2010至2018年的PubMed、Elsevier、Springerlink、中國知網等數據庫發表的相關文章，英文檢索詞有“collagen，crosslinking，immunogenicity，biocompatibility，tissueengineering”，中文檢索詞有“膠原蛋白，交聯，免疫原性，生物相容性，組織工程”。共檢索篩選保留53篇相關文獻，其中英文文獻32篇。

1.2入選標準

文章所述內容為膠原蛋白來源、生物活性、改性及醫用生物材料方面應用相關的報道，排除重復性研究；同一領域選擇近期發表或在權威雜志上發表的文章。

1.3質量評估

計算機初檢索得到1028篇文獻，閱讀標題和摘要進行初篩，排除相似、重復報道，以及陳舊和研究方向不符合的文獻，選取具有代表性且在權威期刊發表的文章共53篇進行綜述。符合納入標準的53篇文獻中，其中8篇是關于膠原蛋白的來源及提取方法報道，10篇是關于膠原蛋白的免疫原性和生物相容性與降解性生物活性研究，35篇關于膠原蛋白功能優化研究及在醫用生物材料方面的應用研究。

2結果Results

2.1膠原蛋白的來源

2.1.1天然膠原膠原蛋白來源廣泛，主要存在于動物的肌腱、骨、皮膚、韌帶等組織中。目前應用較廣的還是以天然獲取的膠原為主，一般從牛、豬、鼠、魚類等動物的肌腱、真皮和尾巴中提取[4]。膠原蛋白的提取方法有酸法、堿法、鹽法、酶法等。堿法提取易導致膠原蛋白變性且會發生消旋反應，一般醫用膠原蛋白不采用此法。因組織材料中可溶性膠原蛋白含量較少，提取率不高，鹽法提取也較少使用。有研究發現堿法和鹽法提取的膠原蛋白三級結構被破壞，沒有完整的三螺旋結構[5]。目前，采用酸法和酶法結合提取膠原蛋白的應用較多。酸性溶劑如乙酸等，可使組織溶脹，打開其交聯鍵，利于膠原蛋白的提取；同時，酶制劑如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有專一性，可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽，而不改變三螺旋結構[6-7]。受動物疾病如瘋牛病、口蹄疫等影響，魚類等水產類膠原蛋白的研究應用越來越受到關注。黃雯[8]選取淡水魚斑點叉尾鮰和海水魚鲅魚皮作為原料，在pH值為6、提取溫度為100℃、料水比為1∶10條件下得到最佳膠原蛋白得率17.59%。目前，天然膠原仍是膠原蛋白原料的主要來源。2.1.2人工合成膠原雖然天然來源的膠原蛋白應用廣泛，但其難以修飾，并可能產生致病和免疫不良反應及其批次間的差異性問題，人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑。重組類人膠原蛋白是采用生物基因工程技術將膠原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到適合的載體然后轉移到宿主細胞中誘導表達得到，具有質量可控、加工性強、水溶性好、周期性短、較低排斥反應等優點，常見的宿主表達系統有大腸桿菌、酵母菌等。He等[9]將羥基化Ⅲ型膠原蛋白通過基因重組技術以pPIC9K質粒為載體，成功地在畢赤酵母GS115表達；通過優化菌體培養條件，在22L發酵罐中進行大規模誘導表達，發酵培養60h，膠原蛋白表達量最高可達4.71g/L[10]。此外，人工化學合成膠原蛋白也是一種來源。Kumar等[11]采用36個氨基酸殘基膠原模擬多肽自組裝設計，形成具有三螺旋結構的納米膠原纖維，研究發現這種人工合成仿生膠原纖維可以黏附和激活血小板，形成凝塊，促進愈合，不引起炎癥反應，具有作為止血劑的潛力。

2.2膠原蛋白的生物學特性

2.2.1免疫原性膠原蛋白的氨基酸為(Gly-X-Y)n周期排列，分子結構重復性高，因此雖然是大分子物質，但其抗原性較低，免疫排斥反應較少。但膠原蛋白仍然會引起免疫反應，研究發現牛跟腱來源的Ⅰ型膠原蛋白連續注射BALB/c小鼠3周，66.8mg/kg劑量即可引起脾淋巴細胞免疫反應，可能導致偶發肝、肺損傷[12]。目前降低膠原蛋白抗原性的方法主要有酶法和超低溫凍存等。酶法主要是采用蛋白酶消化去除膠原蛋白中具有抗原性的終端肽結構[13-14]。李曉輝等[15]研究超高壓及酶對虹鱒魚Ⅰ型膠原蛋白抗原性的影響，結果表明在200MPa、25℃條件下處理10min，膠原蛋白抗原性降低了42.66%；胰蛋白酶在37℃、pH=8.0，酶與底物質量比為1∶10時，膠原蛋白抗原性減少97.69%。超低溫凍存可使抗原結構發生改變及丟失，顯著降低組織抗原性和免疫原性。有研究比較了液氮凍存中不同保護劑及降溫方式對心臟瓣膜組織免疫原性的影響，結果發現同時含有二甲基亞砜和硫酸軟骨素凍存液中的組織免疫原性最低，此外程序控溫比直接降溫方式能獲得更低免疫原性[16]。膠原蛋白的免疫原性去除，仍然是材料專家和臨床醫生關注的重點內容之一。2.2.2生物相容性和降解性膠原蛋白因其組成和生物特性表現出了良好的生物相容性，與細胞周圍環境有著和諧的相互作用機制，可較好地促進人體缺損組織的修復并能夠參與新生組織的重建過程。將酸-酶法提取的牛跟腱膠原蛋白進行生物安全性研究，動物實驗發現純化的膠原蛋白無全身毒性，未引起接觸性皮膚過敏反應，無熱源反應，細胞毒性為Ⅰ級，此方法提取的膠原蛋白具有較高的安全性[17]。有研究發現，重組人膠原納米纖維血液相容性良好，無細胞毒性；細胞支架復合培養體外實驗發現，支架材料能促進成纖維細胞的黏附與增殖，細胞相容性良好；體內實驗表現出低的炎癥反應，具有促進創面愈合的作用[18]。同時，膠原蛋白具有穩定的三螺旋結構，多數蛋白酶僅能切斷膠原蛋白側鏈，但膠原蛋白酶等則能破壞膠原蛋白的螺旋結構，將其水解為小分子的多肽和氨基酸。膠原蛋白在體內降解主要受基質金屬蛋白酶影響，關乎到組織的發育、形成、重塑與修復等重要過程[19]。研究發現受植入部位復雜的組織微環境和宿主反應影響，膠原蛋白在不同植入部位的降解速率有明顯差異，這對平衡生物支架降解率與機體組織再生速度具有重要意義[20]。有研究制備了一種薄的機械性能穩定的非交聯膠原蛋白細胞載體，植入大鼠皮下42d，膠原蛋白載體完全被降解吸收，被自體組織替代，創面愈合過程中沒有發現包囊、瘢痕形成或長期血管化和炎癥[21]。

2.3膠原蛋白的功能優化

膠原蛋白作為天然細胞外基質的主要成分，其獨特的三螺旋結構和膠原纖維對(干)細胞起到較好的支持作用，為細胞的增殖、遷移等創造適宜的微環境。但是在提取過程中，膠原蛋白原有的天然交聯結構會受到不同程度的破壞，缺乏足夠的機械強度，在植入體內很容易被體內蛋白酶水解。為了更好地為體內缺損組織提供必要的力學支撐，通常需要在膠原分子中引入外在交聯或其他材料，以保證膠原材料具有一定的機械強度和保持對蛋白酶的“惰性”。2.3.1交聯改性交聯可影響生物材料的力學性能、吸收動力學和生物相容性與降解性。常用的交聯方法有物理交聯和化學交聯。物理交聯包括紫外光照射、高溫脫水、光敏劑氧化交聯等方法。研究發現，紫外線照射膠原蛋白可提供較低水平的交聯度，膠原蛋白無生物功能喪失，不影響細胞的附著、鋪展和增殖[22]。Bellincampi等[23]發現成纖維細胞能很好地黏附在經紫外輻射和干熱處理交聯的膠原纖維上，并沿著膠原纖維長軸擴散排列。張義[24]研究了將核黃素作為光敏劑用于紫外誘導魚皮膠原蛋白交聯反應，交聯后的膠原膜水接觸角增大，拉伸強度與拉伸系數顯著提升，斷裂延伸率降低。化學交聯劑主要有戊二醛、京尼平、碳二亞胺等。戊二醛是使用較早的一種醛類交聯劑，能在較低濃度下與膠原交聯，改善其親水性和力學性能。研究表明，戊二醛交聯可提高膠原蛋白支架機械強度而不降低其孔徑或孔隙率[25]。京尼平是從梔子果實中提取的化合物，具有羥基、酯鍵等多種活性基團，可直接與氨基酸或蛋白質反應。Zhou等[26]采用京尼平交聯Ⅱ型膠原蛋白，發現0.1%濃度的京尼平能較好地維持膠原支架的基本結構，同時提高其生物穩定性；交聯后的支架能促進脂肪干細胞增殖并分化成髓核樣細胞。碳化二亞胺屬于酰胺型交聯劑，可促進膠原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基與氨基連接形成酰胺鍵。Gao等[27]比較了戊二醛和碳二亞胺交聯膠原蛋白的微觀結構、孔隙率、生物降解性和細胞毒性，結果發現1.2mol/L碳二亞胺交聯后，膠原支架孔隙率與水吸收率顯著變小，兩種交聯劑交聯后支架抗降解性均增強，且力學性能均得到改善；細胞毒性實驗發現，濃度在1%及以上的的戊二醛對細胞有明顯毒性，碳二亞胺則未表現出細胞毒性。2.3.2共混改性引入其他生物材料，與膠原蛋白制成復合材料，是改進膠原蛋白力學性能的有效途徑之一，常用的共混材料有羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、生物活性玻璃、殼聚糖等。羥基磷灰石是骨骼的主要無機組成成分，對骨質增生有刺激或誘導作用，能促進缺損組織的修復。Cholas等[28]采用噴霧干燥法制得平均粒徑6μm的羥基磷灰石微球，將其混合嵌入到多孔膠原蛋白基質中得到復合支架，研究發現復合支架在低應變和高應變值下的壓縮模量分別為純膠原支架的1.7倍和2.8倍，有效改善了膠原支架的力學性能。β-磷酸三鈣具有較好的生物相容性和生物活性，植入體內可逐漸降解，是理想的硬組織修復和替代材料。研究發現，將β-磷酸三鈣粉末引入多孔膠原基質中，有效改善了膠原支架的力學和生物學性能，能有效激活骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，促進血管化，并與周圍組織結合良好[29]。生物玻璃是由SiO2、Na2O、CaO和P2O5組成的硅酸鹽玻璃，具有骨生成性和骨引導作用，與骨和軟組織都有良好的結合性。Long等[30]通過加入生物玻璃材料，解決了膠原蛋白支架在骨組織工程中力學性能不足、多孔結構在濕態下不穩定等問題，制備出骨合成所必須的生物活性和機械穩定性的復合支架，體外細胞實驗表明該支架具有良好的生物相容性，有利于人骨髓基質細胞的伸展和增殖。殼聚糖是天然高分子物質，其生物相容性良好，具有抑菌、止血等功能。Raftery等[31]在膠原蛋白支架中添加殼聚糖，改善了支架的機械性能，提高了抗壓強度、溶脹率，降低了降解率；當殼聚糖和膠原蛋白質量比為25∶75時，間充質干細胞的附著和增殖顯著提高。

2.4膠原蛋白在醫用生物材料方面的應用

2.4.1軟組織修復材料膠原蛋白材料具有天然的多孔網狀結構，與創面接觸可迅速吸附血液，促進血小板凝聚，同時吸收組織滲透液，營造良好創面微環境，促進創面愈合。目前，臨床上膠原蛋白類軟組織修復產品有較多，主要有膠原蛋白敷料、硬腦(脊)膜補片、人工角膜、口腔補片、疝氣補片、乳房整形補片等。有研究比較了可吸收膠原蛋白止血海綿在腔鏡甲狀腺手術中的止血療效，采用止血海綿的觀察組術后12，24，48h的甲狀腺殘腔引流量較對照組分別減少了122%，91%，350%，具有良好的止血效果；同時具有一定的支撐塑形和修復作用，可促進甲狀腺組織修復、保持頸部外觀等[32]。研究發現，膠原蛋白基三維復合活性材料敷料具有較高的生物相容性、溶脹性、孔隙率和抗菌性能，促進細胞黏附和增殖，避免傷口部位感染，加速創面愈合，是潛在的真皮替代材料[33]。雷靜等[34]采用動物實驗研究凝膠型活性膠原輔料對糖尿病皮膚缺損愈合的影響，結果表明膠原凝膠能明顯縮小創面面積，促進血管新生，加快創面愈合；術后4周，與外敷重組人表皮生長因子凝膠的陽性對照組療效相當。羅心凱等[35]研究發現，免縫膠原海綿人工硬腦膜在顱腦損傷修補手術中具有減壓、保護腦功能等作用，且與縫合的人工硬腦膜修補術效果相當，更有利于二期顱骨修補術的開展。2.4.2硬組織修復材料骨組織缺損或病變是臨床上常見的一種病癥，自體骨缺損過大則無法自愈，治療方法主要包括自體骨、異體骨和人工骨移植。自體骨移植供給有限且會造成二次傷害，異體骨有感染疾病風險及免疫排斥等，因此人工骨材料具有廣闊的應用前景。膠原蛋白是天然骨組織的主要有機成分，廣泛應用于人工骨組織工程材料。目前臨床上使用的膠原基骨組織修復材料主要為羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、生物活性玻璃與膠原蛋白等的復合物，具有良好的生物相容性及降解性，對骨缺損部位進行填充與修復，誘導自體骨再生。研究發現γ射線輻照交聯可以誘導羥基磷灰石在膠原蛋白纖維上的高度礦化[36]，礦化膠原與天然骨結構成分相似，相比于單純的羥基磷灰石，可以減輕植入骨假體的炎癥反應，是一種更理想的生物修復材料[37]。研究者采用可注射納米晶磷酸鈣/膠原基骨材料對老年膝關節軟骨損傷進行修復，術后疼痛與膝關節功能情況均顯著優于注射骨水泥的對照組；并且，術后3個月觀察組的血栓栓塞、肺部感染、下肢腫脹等并發癥發生率顯著低于對照組，這充分表明膠原基骨修復材料能有效修復及改善膝關節軟骨損傷[38]。此外，膠原蛋白在引導骨組織再生過程中也發揮著積極作用，可在骨缺損部位形成生物屏障膜，為再生組織細胞的增殖創造良好條件。Wang等[39]研究表明，礦化膠原膜能更好地促進間充質干細胞的黏附、增殖和成骨分化，在骨誘導和骨傳導方面表現優異。目前，膠原基骨修復材料產品已被成功用于人體骨缺損及骨縫充填重建等，表現出了良好的臨床治療效果。2.4.3藥物釋放載體材料研究者們通過控制膠原材料的結構實現對藥物的緩慢釋放，延長藥物在體內的作用時間，以達到更好的藥物治療效果。Hall等[40]研制膠原-聚乳酸基納米纖維控制三氯生和左氧氟沙星抗菌藥的釋放，實驗表明膠原蛋白有助于藥物的持續釋放達192h，避免了藥物在最初24h內的突釋現象。圖1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著。Chen等[41]以膠原蛋白和磷酸鈣納米顆粒制備的多孔復合材料為載體，控制地塞米松緩釋，材料具有高機械強度和可控互連的孔結構，在用于人骨髓間充質干細胞的三維培養，復合支架材料具有良好的生物相容性和促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化，支架植入裸鼠背部皮下能促進異位骨組織再生。Sun等[42]用膠原蛋白復合殼聚糖、透明質酸鈉制備的多孔支架控制kartogenin誘導因子釋放，支架材料具有良好的生物相容性，有促進骨髓基質細胞增殖、軟骨組織再生和修復軟骨與周圍軟骨融合的能力。2.4.4組織工程支架隨著組織工程技術的發展，將傳統的支架材料與種子細胞和生長因子結合起來，能夠對一些復雜的缺損組織進行修復，甚至整個組織器官的替代移植。膠原蛋白用作組織工程支架材料，主要是為種子細胞提供良好的生存空間和微環境，細胞可按預制形態的三維支架生長并可分泌出新的細胞外基質，最終在體外制得具有一定形狀和三維結構的組織或器官。Chan等[43]以Ⅰ型膠原為原料合成膠原支架，體外接種原代人血管內皮細胞，形成了清晰的CD31陽性毛細血管樣結構；在小鼠體內植入支架后，促進新生血管形成，同時支架在8周后逐漸降解。Hoogenkamp等[44]采用一次鑄造法生產無縫大型中空膠原基支架，模擬整個膀胱的形狀，并與輸尿管和尿道吻合口部位集成；發現其利于體內細胞浸潤，上皮細胞和平滑肌細胞能夠附著在支架上并保持其表型，細胞按照所提供的支架模板排列。有研究發現，在向成骨方向分化的人間充質干細胞與血管內皮細胞共培養體系中，膠原水凝膠支架的微環境有助于內皮細胞預血管化和早期骨組織的形成，有助于術后患者植入物與宿主血管吻合[45]。此外，隨著3D打印技術在生物醫療領域的快速發展，能精確控制生物材料、細胞、生長因子等在整體3D結構中的位置、組合與相互作用；并且3D打印技術可為患者制備出個性化的醫用器械，而膠原蛋白因其來源廣泛、結構穩定、可與其他材料復合使用等優點，也是3D打印中常用的原材料之一[46]。目前，3D打印技術已可制備出多種人工組織器官，如髖關節、顱骨、具有仿生結構的血管、完整耳郭，甚至肝臟、心臟、腎臟等復雜器官，但仍然存在可供打印原材料種類偏少、制作成本高、制備周期長等問題。Yang等[47]研究發現，以海藻酸鈉和膠原為生物墨水，基于3D細胞打印軟骨組織工程復合支架，復合支架能明顯促進細胞黏附，促進細胞增殖和增強軟骨特異性基因的表達，有效抑制軟骨細胞去分化和維持表型。

3討論Discussion

膠原蛋白作為一種常見的生物醫用材料，其基礎研究和臨床應用均取得了較大成績，但仍有許多技術問題亟待解決，比如化學交聯法雖改善了膠原蛋白的機械性能，但可能的交聯劑殘留易出現細胞毒性、鈣化及生物相容性不佳等問題[48-49]。因此，有必要對交聯工藝進一步優化，如采用超臨界二氧化碳萃取技術去除殘留的戊二醛或其他交聯試劑[50]。其次，膠原蛋白來源多樣，豬、牛等動物及重組膠原蛋白來源的膠原蛋白在熱穩定性、親水性、孔隙率、力學性能等物化性質上有所差異[51-52]，為保證膠原蛋白產品性質的穩定性，在其來源上需要嚴格篩查鑒定，并進行規模化生產，減小批次間差異。另外，膠原蛋白類產品植入體內后的降解速率調控也是一大難點，如何保證與機體組織再生的速度同步，如何根據植入部位情況進行個性化設計[20]，臨床前動物實驗要考慮實際病癥的復雜性。最后，隨著3D打印技術在生物醫療領域的快速發展，如何制備出適合3D打印的不同類型膠原蛋白材料，并保證在打印過程中蛋白不變性、強度可控、易塑性等[53]，也是將來膠原蛋白研究領域的難點和熱點。

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作者:胡康 張偉 單位：廣東冠昊生物醫用材料開發有限公司